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李君, 谢劲松, 臧桂珍. 酶抑制法测定m-AST试剂性能评价及其在肝病中的意义. 28(12): 1112-1115[LI Jun, XIE Jingsong, ZANG Guizhen. Evaluation on the reagent performance for the determination of m-AST by enzyme inhibition method and the clinical significance of m-AST in patients with liver disease. 上海检验医学, 28(12): 1112-1115]  
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酶抑制法测定m-AST试剂性能评价及其在肝病中的意义
李君, 谢劲松, 臧桂珍
东南大学医学院附属南京第二医院检验科,江苏 南京 210003

李君,女,1966年生,学士,副主任技师,主要从事临床生化检验工作。

摘要
目的

评价酶抑制法测定天门冬氨酸氨基转移酶(AST)线粒体同工酶(m-AST)活性的性能,并探讨m-AST在肝脏疾病中的临床价值。

方法

采用酶抑制法检测m-AST活性[即采用蛋白酶完全抑制AST细胞质同工酶(c-AST)的活性,然后用速率法进行检测],并与免疫抑制法比较。采用酶抑制法检测259例肝病患者(包括急性肝炎43例、慢性病毒性肝炎95例、肝衰竭20例、重型肝炎11例、肝硬化代偿期40例、肝硬化失代偿期9例、原发性肝癌41例)及220名健康体检者(正常对照组)m-AST活性,并与AST比较。

结果

酶抑制法批内变异系数(CV)为0.59%~2.23%,批间CV为5.24%~6.23%;回收率为101.6%~108.0%,平均为104.97%;线性方程Y=0.997X-1.51,r=0.999 9,m-AST活性在450 U/L内线性良好;可完全抑制1 500 U/L的c-AST活性;与免疫抑制法结果呈高度正相关(r=0.999 8);溶血对m-AST检测结果干扰较大;以95%可信区间(]]>±1.96s)初步确定m-AST参考区间男性为3.1~9.5 U/L,女性为2.5~8.7 U/L。肝病患者m-AST活性均高于正常对照组(P<0.05),并与AST呈正相关。正常对照组m-AST/AST比值为0.30±0.07,肝病患者m-AST/AST比值均低于正常对照组(P<0.05),但变化不如m-AST活性明显。

结论

酶抑制法测定m-AST活性自动化程度高,结果准确可靠,重复性好,线性范围宽。m-AST活性能反映肝细胞损伤的严重程度,对肝脏疾病的临床分类和预后具有重要价值。

关键词: 天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶; 天门冬氨酸氨基转移酶; 酶抑制法; 肝病
中图分类号:Q555 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2013)12-1112-04
Evaluation on the reagent performance for the determination of m-AST by enzyme inhibition method and the clinical significance of m-AST in patients with liver disease
LI Jun, XIE Jingsong, ZANG Guizhen
Nanjing Second Hospital, Southeast University School of Medicine, Jiangsu Nanjing 210003,China
Abstract

Objective To evaluate the performance of mitochondrial aspartate aminotransferase (m-AST) by enzyme inhibition method, and to investigate the clinical significance of m-AST in patients with liver disease. Methods The m-AST activity was determined by enzyme inhibition method, and the activity of cytosolic aspartate aminotransferase (c-AST) was inhibited by protease, and was determined by rate method. The results of enzyme inhibition method were compared with those of immune suppression method. A total of 259 patients with liver disease (43 patients with acute hepatitis, 95 patients with chronic viral hepatitis, 20 patients with liver failure, 11 patients with serious hepatitis, 40 patients with compensated liver cirrhosis, 9 patients with decompensated liver cirrhosis and 41 patients with primary liver carcinoma) and 220 healthy subjects (healthy control group) were enrolled. Serum m-AST activity was measured by enzyme inhibition method and evaluated. The m-AST activities were compared with aspartate aminotransferase (AST) activities. Results The within-run coefficient of variation (CV) of enzyme inhibition method was 0.59%-2.23%. The between-runCV was 5.24%-6.23%. The recovery rates were 101.6%-108.0% (the average recovery rate was 104.97%). The linear equation wasY=0.997X-1.51,r=0.999 9. The linearity was up to 450 U/L. The activity of 1500 U/L concentration of c-AST was inhibited completely. The data was positively correlated between enzyme inhibition method and immune suppression method (r=0.999 8). Hemolysis had interference to the m-AST determination results. According to 95% confidence interval (]]>±1.96s), the reference range of m-AST in males was 3.1-9.5 U/L, and that in females was 2.5-8.7 U/L. The activity of m-AST in liver disease group was higher than that in healthy control group (P<0.05), and was positively correlated with AST activity. The ratio of m-AST to AST in healthy control group was 0.30±0.07, and the ratio in liver disease group was lower than that in healthy control group (P<0.05). The decrease degree of m-AST/AST ratio was lower than that of m-AST. Conclusions Enzyme inhibition method for m-AST activity had the advantages of high automation, reliability and wide linear range. The m-AST activity can reflect the degree of liver cell injury. It has significance on clinical classification and prognosis of liver disease.

Keyword: Mitochondrial aspartate aminotransferase; Aspartate aminotransferase; Enzyme inhibition method; Liver disease
引言

血清中天门冬氨酸氨基转移酶(AST)有2种受不同基因控制的同工酶,分别为来自细胞质中的同工酶(c-AST)和来自线粒体的同工酶(m-AST)。AST广泛存在于人体各组织细胞中,尤以心、肝含量最高。c-AST升高表示细胞膜通透性改变,m-AST活性增高表示线粒体膜通透性增加或细胞坏死。因此m-AST检测更能够客观地反映细胞的受损程度[ 1]。检测m-AST活性的方法很多,酶抑制法是近年推出的测定m-AST的新方法。我们对酶抑制法测定m-AST的方法学进行性能评价,并检测了正常人和不同肝病患者血清AST和m-AST。

材料和方法
一、研究对象

选取东南大学医学院附属南京第二医院2011年11月至2012年3月住院的肝病患者259例,其中男149例,女110例,年龄18~75岁;根据2000年全国第10次病毒性肝炎与肝病学会议制定的诊断及分型标准[ 2]确诊,包括急性肝炎43例、慢性病毒性肝炎95例、肝衰竭20例、重型肝炎11例、肝硬化代偿期40例、肝硬化失代偿期9例、原发性肝癌41例。选择同期在东南大学医学院附属南京第二医院体检中心进行体检的健康人220名作为正常对照组,男130例,女90例,年龄18~70岁,均无心、脑、肝、肾等系统疾病。

二、方法

采用酶抑制法测定m-AST活性,试剂中含有的蛋白酶可以完全抑制c-AST的活性,而m-AST活性不受影响,用速率法测定剩余AST活性既为m-AST活性。NADH在340 nm处有特异性吸收峰,而在AST催化过程中NADH易被氧化成NAD+,且氧化速率与AST活性成正比,所以AST活力可以用340 nm处测得的NADH吸光度的下降速率表示。

三、 标本收集

清晨空腹采集外周血3.0 mL,分离血清,所有标本均无溶血和脂血现象,在2 h内完成检测。

四、试剂与仪器

m-AST试剂盒及配套校准品和质控品由宁波普瑞柏生物技术有限公司提供,AST检测试剂盒及配套校准品由北京莱邦生物技术有限公司提供,按试剂盒说明书在HITACHI7600-120全自动生化分析仪上编制好实验参数,用配套校准品校准,室内质控在控后测定标本。

五、方法学评价

1.精密度试验

收集低(25.3 U/L)、中(107.3 U/L)、高(213.0 U/L)3个浓度的患者混合血清标本,连续检测20次,计算批内精密度[变异系数( CV)]。再用上述标本连续测定20 d,上、下午各测1次,计算批间精密度( CV)。

2.回收试验

准备1份混合血清,分4份,每份1 mL,在每份血清中分别加入浓度为113 U/L的m-AST标准品0、0.1、0.2、0.3 mL,再分别加入生理盐水0.3、0.2、0.1、0 mL,通过测定值减去各自原血清浓度确定回收量和回收率。

3.线性试验

取浓度为452 U/L(仪器自动稀释测得结果)的混合血清,用生理盐水按1∶6、2∶5、3∶4、4∶3、5∶2、6∶1、原倍稀释,结果分别为66.8、131.2、195.9、260.4、323.6、389.9、456.2 U/L。以理论值为 Y、测定值为 X计算回归方程。

4.c-AST抑制试验

取新鲜肝脏标本,用0.25 mol/L蔗糖溶液搅匀,高速离心,取上清,用二乙氨基乙基纤维素柱色谱法提纯。初步提纯的m-AST和c-AST再分别依次在磷酸盐缓冲液(100 mol/L,pH值5.5)中层析25 h,在Tris缓冲液(80 mol/L,pH值7.6)中层析12 h,聚乙二醇20000浓缩。纯化的m-AST和c-AST分别用生理盐水配制成3个不同的浓度,再用m-AST和AST试剂(不含抑制酶)分别检测。

5.比对试验

将40份血清标本(范围为3.0~200.0 U/L)同时用酶抑制法( Y)和免疫抑制法( X)(试剂由上海玉兰生物技术研究所生产)在HITACHI7600-120全自动生化分析仪上检测。

6.溶血干扰试验

在高、低2种m-AST浓度的混合血清中分别加入稀释好的不同浓度的血红蛋白(Hb)液,使Hb浓度分别为0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 g/L,对照管中加入同体积蒸馏水,检测m-AST浓度。

7.试剂稳定性

将试剂置于室温(25 ℃),每1 h测1次试剂空白吸光度( A)值;将液体试剂置于4 ℃冰箱保存,每月测1次试剂空白 A值。

五、统计学方法

采用Microsoft Excel2003和SPSS17.0统计软件进行数据处理,计量结果用 ±s表示,组间比较采用 t检验, P<0.05为差异有统计学意义。

结果
一、精密度试验

低(25.3 U/L)、中(107.3 U/L)、高(213.0 U/L)3个浓度标本的批内 CV分别为2.23%、0.59%、0.61%,批间 CV分别为5.45%、5.24%、6.23%。

二、回收试验

3个浓度回收率均在90%~110%以内,平均回收率为104.97%,属可接受范围。见表1:

表1 回收试验(%)
三、线性试验

以理论值为 Y、测定值为 X计算回归方程为 Y=0.997X-1.51,相关系数( r)=0.999 9。酶抑制法检测m-AST在450 U/L范围内线性良好。

四、c-AST抑制试验

分别采用m-AST和AST试剂(不含抑制酶)检测m-AST纯品,检测结果分别为12、60、304 U/L和11、62、306 U/L,差异无统计学意义( P=0.4);c-AST纯品的检测结果分别为0.1、0.2、0.2 U/L和92、378、1 504 U/L。说明酶抑制法m-AST试剂可完全抑制1 500 U/L的c-AST活性,但不影响m-AST活性。

五、比对试验

同时采用酶抑制法( Y)和免疫抑制法测定40份血清样品的回归方程为 Y=0 .985 7 X-0.250 4, r=0.999 8。

六、溶血干扰试验

当Hb浓度分别为0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 g/L、m-AST浓度为11.55 U/L时,偏差分别为0.9%、8.6%、16.7%、42.5%、72.3%;当m-AST浓度为44.55 U/L时,偏差分别为0.6%、4.7%、8.1%、11.3%、21.9%。

七、试剂稳定性

将试剂置室温(25 ℃)时,10 h之内 A值无明显改变;将液体试剂置4 ℃冰箱保存,6个月之内试剂空白 A值基本不变。酶抑制法试剂的稳定性能较好。

八、参考区间

根据SPSS17.0统计软件分析,男、女2组数据均呈正态分布。以95%可信区间( ±1 .96 s)初步确定参考区间男性为3.1~9.5 U/L,女性为2.5~8.7 U/L,男、女性差异有统计学意义( P=0.000),但均在试剂说明书提供的参考区间(≤10 U/L)内。 正常成年人年龄间差异无统计学意义( P>0.05)。

九、不同类型肝病患者m-AST浓度变化

各肝病组m-AST活性均高于正常对照组( P<0.05、 P<0.01);m-AST活性的改变与AST变化呈正相关。随着肝细胞损害程度的不同,m-AST活性升高程度依次为重型肝炎>肝硬化失代偿>急性病毒性肝炎>肝衰竭>慢性病毒性肝炎>原发性肝癌>肝硬化,各肝病组之间差异均有统计学意义( P<0.05)。m-AST/AST比值除肝硬化失代偿组外,其余各肝病组均低于正常对照组( P<0.05);各肝病组中除肝衰竭组m-AST/AST比值低于其他各组( P<0.05)外,其余各组之间差异均无统计学意义( P>0.05),见表2:

表2 对照组及不同肝病组入院时血清m-AST与AST活性测定结果
讨论

m-AST测定早期采用电泳法、离子交换柱层析法等,操作繁琐,受多种因素影响,变异较大,灵敏度低,特异性差;酶免疫法自动化程度低,均不适用于大批量操作。放射免疫法有污染、试剂保存期限短的缺点。近年来报道比较多的免疫抑制法虽特异、准确,自动化程度高,但此方法影响因素较多,尤其与抗体制备及比例有很大的关系,因此各单位测定值相差甚远,文献报道其线性范围通常在120~200 U/L以下[ 3, 4, 5]。本研究使用酶抑制法检测m-AST活性,具有较高精密度和回收率,有良好的准确度和较宽的线性范围;适用于各种全自动生化仪,因此更适宜临床推广和应用。因红细胞中m-AST含量较高,因此溶血对检测结果影响较大。

血清AST属非特异性酶,其升高对诊断具体疾病无特异性,在诊断肝病方面也没有ALT灵敏,但对肝细胞损伤程度的评估是有价值的指标。m-AST 80%分布在线粒体内,正常人血清中AST主要是c-AST,m-AST含量很低甚至无。当肝细胞坏死、线粒体崩解时,附着在线粒体上的m-AST大量释放血中,导致血清m-AST急剧升高。但m-AST在血清中易被网状内皮系统清除,半衰期短,其清除率比c-AST快5倍以上,当细胞不再受破坏时,血清m-AST很快下降,甚至回复正常水平,故m-AST可作预后指标。

本研究各类肝病患者m-AST活性均高于正常对照组( P<0.05),并且随着病情变化,m-AST活性的改变与AST变化呈正相关。随着肝细胞损害程度不同,m-AST升高程度为重型肝炎>肝硬化失代偿>急性病毒性肝炎>肝衰竭>慢性病毒性肝炎>原发性肝癌>肝硬化,各肝病组之间m-AST差异均有统计学意义( P<0.05),提示m-AST活性测定可作为判断肝细胞损伤程度的可靠指标,对肝脏疾病的临床分类和预后具有一定价值。

220名正常人m-AST/AST比值为0.30±0.07,这与国外文献[ 6]报道的10%以下有很大不同,而国内不同文献报道差异很大[ 5, 7, 8, 9],主要原因可能与方法学不同有关,近年文献报道均为免疫抑制法,此法影响因素较多。本研究结果还显示除失代偿期肝硬化患者外,其余各组患者的m-AST/AST比值低于正常对照组( P<0.05),与毛小红[ 8]的报道一致。肝衰竭患者m-AST/AST比值低于其他各组( P<0.05)外,其余各组间差异无统计学意义( P>0.05)。表明m-AST/AST比值的变化不如m-AST活性变化明显,原因为肝细胞发生严重损伤时m-AST大量释放,但m-AST清除率比c-AST快,故血清中m-AST与总AST活性同步升高。因此m-AST绝对值临床意义更重要。

本研究失代偿期肝硬化患者m-AST与AST的相关系数仅为0.61。原因可能与患者病情加重、酶胆分离有关,但因病例数太少,尚需进一步研究。

The authors have declared that no competing interests exist.

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