引用本文
徐维家, 温杰, 刘毅. 1-棕榈酰溶血磷脂酰胆碱在诊断缺血性心脏病中的价值研究. 2012, 27(8): 654-658
XU Weijia, WEN Jie, LIU Yi. Research on the significance of 1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine in the diagnosis of ischemic heart disease. Labratory Medicine, 2012, 27(8): 654-658  
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1-棕榈酰溶血磷脂酰胆碱在诊断缺血性心脏病中的价值研究
徐维家1, 温杰2, 刘毅1
1. 大连市中心医院检验科,辽宁 大连 116033
2. 大连市体检中心检验科,辽宁 大连 116033

作者简介:徐维家,男,1953年生,主任技师,主要从事临床生物化学检验工作。

摘要
目的

筛选缺血性心脏病(IHD)患者血清内发生重要浓度变化的代谢物并探讨其临床价值。

方法

检测52例IHD患者和45名正常对照者10项与诊断心肌缺血或梗死有关的血液常规生化指标[包括丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、γ-谷氨酰基转移酶(GGT)、碱性磷酸酶(ALP)、乳酸脱氢酶(LDH)、α-羟丁酸脱氢酶(α-HBDH)、肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)、肌酸激酶(CK)、C-反应蛋白(CRP)和心肌肌钙蛋白T(cTnT)]。血清中主要代谢物的代谢组学分析利用高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)技术进行。相应数据经统计分析后,筛选并鉴定出有重要变化的代谢物。

结果

应用HPLC-MS发现4个平均质荷比(m/z)分别为496.33、478.34、184.13和991.71的离子碎片。经鉴定,4个离子碎片均来自于1-棕榈酰溶血磷脂酰胆碱(C16:0)。IHD组血清1-棕榈酰溶血磷脂酰胆碱(C16:0)浓度为(76.35±18.28)μmol/L,明显高于正常对照组[(64.24±15.56)μmol/L, P<0.001]。IHD组其他传统心肌指标与对照组比较,除AST升高外( P<0.05),其余9项均无明显差异( P>0.05)。受试者工作特性(ROC)曲线显示,诊断IHD时1-棕榈酰溶血磷脂酰胆碱(C16:0)的ROC曲线下面积(0.90±0.03)显著高于其他常规生化指标( P<0.05)。

结论

1-棕榈酰溶血磷脂酰胆碱(C16:0)对IHD具有重要的临床价值。

关键词: 1-棕榈酰溶血磷脂酰胆碱; 缺血性心脏病; 液相色谱-质谱
中图分类号:R446.1 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)08-0654-05
Research on the significance of 1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine in the diagnosis of ischemic heart disease
XU Weijia1, WEN Jie2, LIU Yi1
1. Department of Clinical Laboratory, Dalian Municipal Central Hospital,Liaoning Dalian 116033,China
2. Department of Clinical Laboratory, Dalian Health Examination Center,Liaoning Dalian 116033,China
Abstract
Objective

To screen the most significantly changed metabolite in the sera of patients suffering from ischemic heart disease(IHD), and investigate its clinical significance.

Methods

A total of 10 biochemical parameters involved in the diagnosis of ischemic diseases or infarction were determined including alanine aminotransferase(ALT),aspartate aminotransferase(AST),gamma-glutamyltransferase(GGT),alkaline phosphatase(ALP),lactate dehydrogenase(LDH), alpha-hydroxybutyrate dehydrogenase(α-HBDH),creatine kinase-MB(CK-MB),creatine kinase(CK), C reactive protein(CRP) and cardiac troponin(cTnT) between 52 IHD patients and 45 controls. A strategy of high performance liquid chromatography-mass spectrometry(HPLC-MS) technique was used to explore the major metabolic changes in the sera of the 2 groups in view of metabolomics. The acquired data were subjected to the significance analysis to select and identify the most importantly changed metabolite.

Results

The results showed that 4 ion fragments were found between the 2 groups, whose average mass charge ratios (m/z) were 496.33,478.34,184.13 and 991.71. They were finally confirmed to be originated from 1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(C16:0). The concentration of this metabolite was (76.35±18.28)μmol/L in IHD patients, which was higher than that in the controls [(64.24±15.56)μmol/L, P<0.001]. The 9 traditional serum parameters were not different between the patients and the controls( P>0.05), except the slightly elevated AST in the IHD group ( P<0.05). Receiver operating characteristic(ROC) curve indicated that area under the curve of 1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (C16:0)(0.90±0.03) was larger than that of the other traditional biochemical parameters( P<0.05).

Conclusions

1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (C16:0) has clinical significance for the diagnosis of IHD.

Keyword: 1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine; Ischemic heart disease; Liquid chromatography-mass spectrometry

心血管疾病是严重威胁人类健康的头号杀手之一, 缺血性心脏病(ischemic heart disease, IHD)是其中十分常见的一种。据统计, 美国大约有25%的65岁以上老年人患有IHD[1]。目前针对IHD的诊断手段主要有核磁共振成像技术、血管造影技术、超声和心电图等。除上述影像学检测外, 传统的心肌酶学指标也曾被用于IHD的诊断, 但是诊断价值十分有限[2]。

随着现代分析技术的发展, 一种被称为代谢组学(metabolomics)的技术在继基因组学和蛋白质组学后又被提了出来。这种技术是通过对细胞或生物个体(所有)代谢物的定性和定量分析反映个体的表型特征或差异[3]。该领域内的主流分析技术主要包括核磁共振(NMR)和质谱(MS)等[4], 已经被广泛应用到药物毒性评价、疾病分型和新标志物发现等各个领域[5]。我们利用高效液相色谱(HPLC)-MS联用技术对IHD患者进行血清代谢物分析, 以期找到能够反映IHD存在的重要血清代谢物并探讨其诊断价值。

材料和方法
一、材料

1. 对象 52例IHD患者来源于大连市中心医院, 男39例, 女13例, 年龄49 ~ 68 岁。经心电图检查ST 段水平下移≥ 0.1 mV或冠状动脉造影显示冠状动脉狭窄≥ 50%[6]。对照组为45名年龄和性别相匹配的健康体检者, 来自大连市体检中心。所有受试者均得到知情同意后参与本研究。

2. 样本采集与处理 所有对象均为清晨空腹采集静脉血于血清分离胶型采血管内, 4 ℃ 3 000× g离心5 min后分离血清, 取200 μ L血清加入600 μ L 乙腈(美国Merck公司), 震荡混匀, 置 4 ℃静置10 min后10 000 × g 4 ℃离心10 min沉淀蛋白成分。另取600 μ L上清在-50 ℃真空冷冻干燥机(美国LABCONCO公司)中冻干备用。1-棕榈酰溶血磷脂酰胆碱标准品购自SIGMA-ALDRICH公司。

二、方法

1. 血清学指标检测 传统的心肌酶学指标检测项目包括丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、γ -谷氨酰基转移酶(GGT)、碱性磷酸酶(ALP)、乳酸脱氢酶(LDH)、α -羟丁酸脱氢酶(α -HBDH)、肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)、肌酸激酶(CK)、C-反应蛋白(CRP)和心肌肌钙蛋白T(cTnT)。其中cTnT采用电化学发光法检测, 在罗氏cobas e 601电化学发光分析仪上完成, 试剂盒由罗氏公司提供; CRP采用速率免疫散射比浊法检测, 在贝克曼-库尔特IMMAGE全自动生化分析仪上完成, 试剂盒由贝克曼-库尔特公司提供; 其余项目检测均在西门子AVDIA2400生化分析仪上完成, 试剂盒由科华公司提供。

2. HPLC-MS分析 HPLC分析采用Prominence LC 系统(日本Shimadu公司), 色谱柱为Shimpack XR- ODS[250 mm× 2.0 mm(i.d.) ]。流动相A为0.1% 甲酸 (美国Merck公司)-水, 流动相B为 0.1%甲酸-乙腈 (美国Merck公司)。洗脱梯度:0~35 min为2%~98%(v/v)的线性梯度B, 然后98%的流动相B保持到38 min, 最后用2%流动相B平衡7 min 。总流速为0.3 mL/min, 柱温35 ℃。冻干样本复溶于160 μ L乙腈/水 (3∶ 1, v/v)中, 每次进样体积4 μ L。MS检测用Shimadzu 离子阱飞行时间质谱系统, 准确质量数用三氟乙酸校正。分析条件为:扫描范围[质荷比(m/z)]为100~800; 接口电压 4.50 kV; IT 真空 1.2× 10-2 Pa, TOF 真空1.2× 10-4 Pa, 仪器温度 40 ℃; 雾化气 (N2) 流速1.5 L/min; 干燥气(N2)压力 0.2 MPa; CDL 和加热块温度200 ℃; 阳极电压4.5 kV; 阴极电压-3.5 kV; 离子累积时间20 ms。

三、统计学方法

统计分析采用MINITAB V15软件进行。所有MS数据都转换成NetCDF格式然后用XCMS软件处理以提取化合物离子碎片信息和进行峰匹配[7]。数据统计分析按照文献[8]方法进行微阵列显著性分析(SAM)分析, 其目的是找到在2组样本中, 绝对量的变化程度最为显著的碎片离子然后鉴定其母体化合物。

结 果
一、正常对照组与IHD组的传统生化指标

检测结果见表1。除AST以外(P< 0.05), 所有指标在2组中无明显差异(P> 0.05)。

表1 IHD组及对照组血清生化指标检测结果

二、典型的IHD患者和正常对照者血清代谢物HPLC-MS分析结果

见图1。经过SAM分析后发现, 当错误发现率(false discovery rate, FDR)为0时, 有4个离子碎片在2组中具有明显的强度变化, 其色谱保留时间均为18.95 min, 说明很可能来自于同一母体化合物, 其平均质荷比(m/z)分别是496.33、478.34、184.13和991.71。见图2。

图1 典型的IHD患者与正常对照者血清HPLC-MS分析谱图

图2 血清化合物HPLC-MS检测结果的SAM分析

三、对图2中发现的4个离子碎片进行进一步的多级质谱分析

发现m/z 496.33的碎片离子在二级质谱上可以进一步碎裂成2个碎片(m/z 184.13和m/z 313.36)。而m/z 991.71也可以

在其二级质谱上发现m/z 496.33的碎片, 该碎片同样也可以再碎裂为2个离子碎片(m/z 184.13和m/z 313.36)。结合离子强度信息可初步判断m/z 496.33极有可能是分子离子加氢峰(M+H+), 即化合物分子上结合了一个质子。利用该质量数搜索HMBD(www.hmbd.ca)化合物数据库提示, 对应分子可能是一种溶血磷酰胆碱。经过标准品化合物的多级质谱信息比对分析, 最后鉴定出图2中的4个离子碎片均来自于1-棕榈酰溶血磷脂酰胆碱(C16:0)。图3显示了该化合物的质谱谱图特征。利用标准品化合物配置的标准溶液做工作曲线, IHD组及正常对照组血清1-棕榈酰溶血磷脂酰胆碱(C16:0)的浓度分别为76.35± 18.28和(64.24± 15.56)μ mol/L, 二者比较差异有统计学意义(P< 0.001)。

图3 1-棕榈酰溶血磷脂酰胆碱(C16:0)的一级和二级质谱图特征

四、受试者工作特性(ROC)曲线分析

表明, 传统的各心肌损伤指标的ROC曲线下面积(AUC)之间无明显差异(P> 0.05), 均明显低于1-棕榈酰溶血磷脂酰胆碱(C16:0)的AUC(0.90± 0.03)(P< 0.05); 即使是AST的AUC值也明显低于1-棕榈酰溶血磷脂酰胆碱(C16:0)。见图5。

图5 各项指标的ROC曲线分析

讨 论

心肌梗死是典型的IHD, 也是心肌缺血导致的较为严重的后果之一, 危害极大。近几年来国内外学者都在关注心肌梗死标志物的寻找, 特别是一些反映心肌缺血导致的损伤的早期生化标志物。比如脂肪酸结合蛋白(FABP)、缺血修饰蛋白等。关于IHD的标志物研究, 许多血浆蛋白成分变化都被发现与IHD有关, 比如CRP、血管内皮素B、蛋白C、脱氧核糖核酸酶-1以及载脂蛋白A(apo A)等。但是关于IHD时的血清代谢物组分变化的研究相对较少。国内有报道发现血尿酸浓度在IHD患者中显著升高。国外学者通过对919例患者的观察发现空腹血浆高皮质醇浓度与IHD的发生相伴而行[9]。本研究发现IHD组血1-棕榈酰溶血磷脂酰胆碱(C16:0)浓度明显高于正常对照组。溶血磷脂酰胆碱是哺乳动物磷脂的代谢产物之一, 是磷脂酰胆碱的磷脂酶A2的水解产物, 广泛参与包括炎症反应在内的多种生理病理过程[10]。曾有研究认为溶血磷脂酰胆碱在心肌缺血导致的病理损伤中起重要作用[11]。急性心肌缺血将导致细胞内K+的外流, 而试验证实1-棕榈酰溶血磷脂酰胆碱(C16:0)能导致家兔心肌细胞K+的外流, 并能造成与心肌缺血损伤时一致的心电图表现[12]。溶血磷脂酰胆碱还能导致心肌细胞内Ca2+浓度增加, 导致类似IHD时的细胞病理改变。另外动脉粥样硬化斑块组织中也曾被发现有高表达的磷脂酶A2成分, 同时伴有高浓度的溶血磷脂酰胆碱生成[13]。抑制缺血心肌的溶血磷脂酰胆碱生成对心肌细胞有保护作用[14]。因此本研究中发现的1-棕榈酰溶血磷脂酰胆碱(C16:0)的浓度变化应该与IHD有直接关系, 并一定程度上反映了IHD的存在。虽然IHD还可能导致血清中的其他一些化合物成分的改变, 但是绝对量变化最大的化合物并不一定与生物体生理状态的改变直接相关, 相反, 变化程度的显著性才能反映表型的变化[15]。因此本研究采用了SAM分析的方法筛选具有重要价值的化合物, 并最终发现了1-棕榈酰溶血磷脂酰胆碱(C16:0)在2组人群中的显著差异。通过ROC曲线分析也的确显示出该化合物的诊断价值十分可观, AUC可达0.90± 0.03, 远远优于传统心肌酶学指标。说明在判断IHD的存在与否时, 1-棕榈酰溶血磷脂酰胆碱(C16:0)的临床价值要明显高于传统生化指标。由于本研究仅仅观察了52例患者, 所得到的试验数据是否适用于更多的IHD患者, 还有待于进一步试验验证。

对血清化合物的检测本研究采用了HPLC-MS为基础的代谢组学检测策略, 该方法能够实现尽可能多地对各种化合物进行全面检测。能够最大限度地满足从诸多化合物中筛出有价值的组分供后续分析和鉴定。因此在未来的检验医学实践中, 代谢组学策略将会发挥越来越大的作用。

The authors have declared that no competing interests exist.

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