采用Roche公司的E601全自动电化学发光免疫分析仪及配套试剂盒。

随机抽取20份门诊患者的静脉血液, 一针两管, 分别注入带分离胶的促凝试管, 其中一管37 ℃水浴30 min后3 000× g离心10 min, 作为非溶血标本。另一管放置-20 ℃冰箱保存2 h后取出融化, 3 000× g离心10 min, 分离溶血血清, 用SYSMEX XT-1800i全自动血液分析仪测定血红蛋白(Hb)浓度, 然后通过计算用相对应患者的非溶血血清调整Hb含量为8、4、2、1 g/L的溶血标本。测定人绒毛膜促性腺激素(β -HCG)项目则选择定性试验阳性的早孕患者, 标本处理方法相同。

使用同一批次的试剂同时测定非溶血以及4种不同程度溶血标本的促甲状腺激素(TSH)、三碘甲状腺原氨酸(T3)、甲状腺素(T4)、游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、游离甲状腺素(FT4)、甲状腺球蛋白(Tg); 促黄体生成素(LH)、促卵泡生成激素(FSH)、催乳素(PRL)、雌二醇(E2)、孕酮(PROG)、睾酮(TESTO); 甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、总前列腺特异性抗原(PSA)、游离前列腺特异性抗原(FPSA)、β -HCG、糖类抗原125(CA125)、糖类抗原15-3(CA15-3)、糖类抗原19-9(CA19-9)、非小细胞肺癌相关抗原21-1(CYFRA21-1)、糖类抗原72-4(CA72-4)、NSE、铁蛋白、C-肽(C-Peptid)、INS、叶酸(FA)、维生素B12(Vit B12)共28个项目。

1. 统计学方法 应用SPSS Ver12.0.1 for windows统计软件分析, 测定结果以 x̅± s表示, 多样本比较采用单因素方差分析, 每一测定项目均经方差齐性检验, 两两比较采用LSD检验, P< 0.05表示差异有统计学意义。

2. 溶血干扰的评价方法 按以下公式评价溶血对测定的影响:|F|=(X-X₀)/X₀。式中:|F|为溶血引起的误差; X为溶血血清待测物平均浓度; X₀为非溶血血清待测物平均浓度。若|F|> 0.10, 表示溶血干扰客观存在; 若|F|< 0.10, 表示溶血干扰轻微, 可以忽略不计。

溶血对28项指标中4项指标产生一定的干扰。其中标本溶血可使INS浓度降低(P< 0.05), 使FA、NSE浓度升高, 且溶血程度越严重, 变化越明显(P< 0.05、P< 0.01); 重度溶血有使铁蛋白测定有使结果偏高的趋势, 但与非溶血组比较差异无统计学意义。见表1。溶血对ECLIA测定其余24项指标均无干扰。

表1

表1

表1 溶血对ECLIA测定有干扰的项目分析 ( x̅± s) 组别 例数 INS(μ U/mL) NSE(ng/mL) FA(ng/mL) 铁蛋白(ng/mL) 非溶血组 20 9.85± 3.76 13.79± 3.38 7.64± 2.06 351.12± 79.19 溶血组(Hb含量) 1 g/L 20 9.29± 3.64* 52.58± 13.94* * # 10.92± 3.04* # 375.15± 82.66 2 g/L 20 8.52± 3.28* * # 87.92± 24.69* * # 14.31± 4.48* # 380.45± 83.82 4 g/L 20 6.84± 2.71* * # 258.25± 70.08* * # 23.35± 8.35* # 384.05± 88.14 8 g/L 20 4.23± 1.75* * # 548.95± 149.08* * # 38.64± 15.27* # 392.00± 82.86# 注:与非溶血组比较, * P< 0.05、* * P< 0.01; # |F|> 0.10

表1 溶血对ECLIA测定有干扰的项目分析

INS是一种肽类激素, 主要由胰岛B细胞分泌, 其血清浓度测定对糖尿病分型具有重要意义。红细胞中含有INS降解酶(insulin degrading enzyme, IDE)^{[2, 3]}。IDE是一种过氧化物水解酶, 能够高效、特异地降解INS, 被认为是在细胞水平降解INS最主要的酶。随着红细胞的破坏, 其内存的IDE释放进入血清, 能导致溶血标本INS浓度降低。本研究显示, 溶血标本的溶血程度越严重, INS浓度越低。

NSE作为一种存在于正常人脑组织中的细胞内酶, 其血清或脑脊液中浓度异常升高是辅助诊断起源于神经内分泌细胞或神经元肿瘤(如神经母细胞瘤或小细胞肺癌)较为敏感和特异的指标, 其浓度监测亦可作为评估治疗效果的一种有效手段。NSE同样也存在于红细胞和血小板中^[4], 溶血或离心不充分将会导致标本的测定结果显著升高; 邹自英等^[5]的研究表明, 溶血使血清中Hb浓度每增加1 克, 将导致NSE测定结果增加34.53 μ g/L。

FA是一种水溶性B族维生素, FA对细胞的分裂生长及核酸、氨基酸、蛋白质的合成起着重要的作用, 是正常代谢、DNA合成和生成红细胞必需的物质。FA缺乏可引起巨幼细胞性贫血和白细胞减少, 怀孕期间血清FA水平低下与胎儿神经管缺陷有关。红细胞中FA浓度约为血清的16.7倍, 因此溶血会导致FA测定值明显升高。

铁蛋白是反映储存铁最敏感的指标。铁蛋白也是一种急性时相蛋白, 在炎症或肿瘤时会明显增高, 铁蛋白广泛分布在体液、组织和细胞中, 在肝、脾、骨髓中含量最高, 外周血包括红细胞、白细胞、血小板和单核细胞都含有微量的铁蛋白。其中红细胞内铁蛋白含量为0.25 fg/细胞; 粒细胞为6.6 fg/细胞; 淋巴细胞为8.0 fg/细胞; 单核细胞为54.6 fg/细胞^[6]。由于标本溶血释放的Hb也是一种含铁蛋白, 在使用免疫学方法定量铁蛋白时可能与铁蛋白抗体存在非特异性反应, 从而使测定结果偏高。本研究显示, 虽然溶血前、后铁蛋白有增高的趋势, 但差异无统计学意义, 在溶血血清Hb> 8 g/L时使用Sonntag^[7]的评价方法提示溶血干扰客观存在。

有研究表明, 使用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测某些肿瘤标志物如CEA、AFP、β -HCG等项目时标本溶血会导致结果假性升高, 其原因可能为红细胞破坏释放的亚铁血红素具有类似过氧化物酶的活性, 其作用效应与反应体系中的标记物辣根过氧化物酶(HRP)类似, 会使加入的底物液[3, 3', 5, 5'-四甲基联苯胺(TMB)]产生显色反应, 造成假阳性或使结果偏高^[8]。

有学者发现, 使用放射免疫方法(RIA)测定部分甲状腺功能、肿瘤标志物和性激素项目, 轻、中度溶血对测定结果无影响, 重度溶血由于稀释效应会使结果偏低, 但差异无统计学意义(P> 0.05)^{[9, 10]}。虽然RIA具有较强的抗干扰能力, 但存在同位素放射污染风险, 在临床上已逐渐趋于淘汰。

ECLIA系统具有特异性强、敏感性高、无放射性危害及检测快速等特点, 其免疫反应原理与放射免疫和酶免疫中的竞争法、双抗体夹心法相似, 但其某些特有技术可明显降低或避免反应体系中可能存在的非特异性干扰, 如:(1)使用专利的生物素-链霉亲和素包被技术, 将以三联吡啶钌为示踪物质的抗原抗体复合物结合到直径为2.8 μ m的磁珠载体上, 这种结合体具有高度特异性和牢固性, 并且链霉亲和素不含糖基, 这对检测某些肿瘤相关糖基抗原不产生非特异性干扰; (2)通过磁性分离技术, 实现了结合相与游离相的完全分离, 避免了交叉污染和细胞溶解后残留物的干扰; (3)使用可精确控制的电位差而非通过化学反应产生的化学能作为能量激发源, 从而避免了某些细胞成分干扰氧化还原反应; (4)标记物三联吡啶钌在无电场和递电子体(三丙胺)存在的自然环境下非常稳定, 因此用其标记的抗原(抗体)试剂也非常稳定。

综上所述, 虽然构成血细胞的化学成分十分复杂, 但只要血细胞内不含待测物质, 或者溶血后血细胞破坏释出成分不干扰反应体系, 理论上溶血对ECLIA测定结果没有影响, 除某些特定项目(INS、FA、NSE)外大部分溶血标本的测定结果仍然具有临床意义。由于目前国内使用ECLIA检测的仪器和试剂均依赖国外进口, 成本较高, 并且引起标本溶血的因素和环节较多, 在临床上不可完全避免, 重复检验会增加患者的痛苦和经济负担。因此检验师和临床医师了解溶血对ECLIA测定结果的影响或干扰是很有必要的。