引用本文
赵文杰, 周洪兴, 王苏建, 吴建康, 王家平, 张平. 肺癌患者血浆及外周血单个核细胞 Lunx mRNA检测的临床意义 . 2012, 27(8): 631-634
ZHAO Wenjie, ZHOU Hongxing, WANG Sujian, WU Jiankang, WANG Jiaping, ZHANG Ping.. The clinical significance of Lunx mRNA detection in plasma and peripheral mononuclear cells in patients with lung cancer . Labratory Medicine, 2012, 27(8): 631-634  
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肺癌患者血浆及外周血单个核细胞 Lunx mRNA检测的临床意义
赵文杰, 周洪兴, 王苏建, 吴建康, 王家平, 张平
南京医科大学附属常州市第二人民医院检验科,江苏 常州 213003

作者简介:赵文杰,男,1971年生,主管技师,主要从事血液学检验工作。

通讯作者:周洪兴,联系电话:0519-81087713。

摘要
目的

检测肺癌患者血浆及外周血单个核细胞肺特异性X基因( Lunx) mRNA,探讨两者对肺癌辅助诊断的临床意义。

方法

采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测肺癌患者、肺良性疾病患者、肺外肿瘤患者及健康人血浆及外周血单个核细胞 Lunx mRNA。

结果

肺癌组患者血浆 Lunx mRNA阳性率显著高于肺良性疾病组( χ2=113.10, P<0.01)、肺外肿瘤组( χ2=125.34, P<0.01)和健康组( χ2=100.33, P<0.01);Ⅲ~Ⅳ期肺癌患者血浆 Lunx mRNA阳性率高于Ⅰ、Ⅱ期肺癌患者( χ2=7.07, P<0.05)。肺癌组患者外周血单个核细胞 Lunx mRNA阳性率显著高于肺良性疾病组( χ2=32.79, P<0.01)、肺外肿瘤组( χ2=44.44, P<0.01)和健康组( χ2=44.44, P<0.01);Ⅲ~Ⅳ期肺癌患者外周血单个核细胞 Lunx mRNA阳性率显著高于Ⅰ、Ⅱ期肺癌患者( χ2=24.52, P<0.01)。血浆 Lunx mRNA检测对肺癌辅助诊断的敏感性高于单个核细胞检测的敏感性( χ2=36.46, P<0.01),血浆检测的阴性预测值高于外周血单个核细胞检测的阴性预测值( χ2=16.37, P<0.01)。

结论

血浆与外周血单个核细胞 Lunx mRNA检测均可用于肺癌的辅助诊断,前者敏感性较后者高。

关键词: 肺特异性X基因; 循环RNA; 循环肿瘤细胞; 聚合酶链反应; 肺癌
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)08-0631-04
The clinical significance of Lunx mRNA detection in plasma and peripheral mononuclear cells in patients with lung cancer
ZHAO Wenjie, ZHOU Hongxing, WANG Sujian, WU Jiankang, WANG Jiaping, ZHANG Ping.
Department of Clinical Laboratory, Changzhou Second People's Hospital, Nanjing Medical University, Jiangsu Changzhou 213003, China
Abstract
Objective

To investigate the clinical auxiliary diagnosis significance of lung-specific X gene ( Lunx) mRNA detection in plasma and peripheral mononuclear cells in patients with lung cancer.

Methods

Lunx mRNA in plasma and peripheral mononuclear cells was detected by fluorescence quantitation polymerase chain reaction (PCR) in patients with lung cancer, benign lung disease, extrapulmonary tumor and healthy subjects.

Results

The positive rate of Lunx mRNA from plasma in lung cancer group was significantly higher than those in benign lung disease group ( χ2=113.10, P<0.01), extrapulmonary tumor group ( χ2=125.34, P<0.01) and healthy subjects ( χ2=100.33, P<0.01). The positive rate of Lunx mRNA in plasma in patients with Ⅲ-Ⅳ stages of lung cancer was significantly higher than that in patients with Ⅰ-Ⅱ stages of lung cancer ( χ2=7.07, P<0.05). The positive rate of Lunx mRNA in peripheral mononuclear cells in lung cancer group was significantly higher than those in benign lung disease group ( χ2=32.79, P<0.01), extrapulmonary tumor group ( χ2=44.44, P<0.01) and healthy subjects ( χ2=44.44, P<0.01). The positive rate of Lunx mRNA in peripheral mononuclear cells in patients with Ⅲ-Ⅳ stages of lung cancer was significantly higher than that in patients with Ⅰ-Ⅱ stages of lung cancer ( χ2=24.52, P<0.01). For the auxiliary diagnosis of lung cancer, the sensitivity of Lunx mRNA detection in plasma was higher than that in mononuclear cells ( χ2=36.46, P<0.01). The negative predictive value of the Lunx mRNA detection in plasma was higher than that in mononuclear cells ( χ2=16.37, P<0.01).

Conclusions

The detection of Lunx mRNA in plasma and peripheral mononuclear cells can be used for the auxiliary diagnosis of lung cancer. The sensitivity in plasma is higher than that in mononuclear cells.

Keyword: Lung-specific X gene; Circulating RNA; Circulating tumor cell; Polymerase chain reaction; Lung cancer

肺癌是呼吸道常见恶性肿瘤, 由于肺癌早期症状不明显, 一旦确诊大部分已属中晚期, 早期诊断、早期治疗是提高肺癌患者生存率的关键[1]。在常规健康体检中, 与肺癌相关检查一般仅有胸部X光片及一些比较成熟的肿瘤标志物, 如癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)、细胞角蛋白片段CYFRA-211、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase, NSE)等。早期肺癌肿块较小且由于存在体位等因素的影响, X线检查常无法显现肿块[2]。而上述肿瘤标志物敏感性有限且对于肺癌均不特异。寻找一种取材较易且有较高敏感性与特异性的肺癌标志物用于辅助诊断具有十分重要的意义。

有研究表明在肿瘤组织生长过程中既有肿瘤细胞亦有游离核酸进入外周血[3, 4, 5], 因此检测血浆及外周血单个核细胞中肺癌特异基因的表达将是一种对肺癌进行辅助诊断的新思路。肺特异性X基因(lung-specific X, Lunx)是Iwao等[6]采用mRNA差异显示技术筛选克隆的一个人类肺组织特异性基因, 在肺以外其他肿瘤组织中不表达或表达极少[7]。检测肺癌患者血浆及外周血单个核细胞中Lunx mRNA对肺癌可能有重要的辅助诊断价值。

材料和方法
一、研究对象

选取2008年12月至2011年1月来常州市第二人民医院呼吸科就诊, 并被确诊为原发性肺癌的患者108例, 男65例, 女43例, 年龄31~87岁, 平均63.1岁。所有患者住院期间均经病理切片检查并依据国际抗癌联盟(UICC)所提出的TNM分期标准(2009版)将患者分为Ⅰ ~Ⅳ 期。其中Ⅰ 期19例(包括T1N0M0 7例、T2aN0M0 12例), Ⅱ 期40例(包括T1N1M0 6例、T2bN0M0 11例、T2aN1M0 13例、T2bN1M0 10例), Ⅲ ~Ⅳ 期49例(包括T2N2M0 4例、T3N1M0 14例、T3N2M0 12例、T4N2M0 11例、T3N3M0 5例、T2N2M1a 2例、T3N3M1a 1例)。另选取同期来院治疗的其他肺部疾病患者86例作为良性疾病组, 包括大叶性肺炎33例、痰结核菌培养阳性的肺结核患者12例、慢性支气管炎41例, 年龄21~89岁, 平均59.4岁。选取肺以外其他恶性肿瘤患者100例作为特异性对照组, 该组患者均为原发性, 包括肝癌20例、胃癌30例、食管癌20例、结肠癌30例, 年龄32~83岁, 平均66.2岁。选取来常州市第二人民医院体检, 血常规、肝肾功能、胸部X光片均正常者88名作为健康对照组, 年龄41~68岁, 平均年龄57.8岁。

二、试剂

全血细胞RNA提取试剂盒(QIAamp RNA Blood Mini Kit)、血浆RNA提取试剂盒(QIAamp Viral RNA Mini Kit)、去RNA酶DNA消化酶(RNase-Free DNase Set)购自凯杰生物技术(上海)有限公司; TaKaRa PrimeScript 逆转录(RT)-聚合酶链反应(PCR)定量试剂盒、pMD18-T克隆试剂盒、质粒提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit)购自上海皓嘉科技发展有限公司; PCR引物及TaqMan探针由上海生工生物工程有限公司合成, 序列为跨外显子设计, 见表1。

表1 Lunx与β -actin的定量PCR扩增引物及探针序列
三、RNA提取与逆转录

所有患者在未接受正规治疗前均空腹采集静脉血2.0 mL, 健康对照组在前来体检时采集静脉血2.0 mL, 所有血标本均乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝, 2 h内 2 800× g离心15 min, 吸取上层血浆800 μ L, 按照血浆RNA提取试剂盒说明书提取血浆总RNA。剩余全血按全血细胞RNA说明书提取全血单个核细胞总RNA。提取的RNA按说明进行DNA酶消化, 去除残存的DNA。随即按RT-PCR试剂盒中逆转录部分的操作说明将RNA逆转录成cDNA。反应总体系为20 μ L, 包括4 μ L 5× PrimeScript Buffer、4 μ L Random 6 mers、1 μ L oligo dT Primer、1 μ L PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ 、5 μ L纯化的RNA及5 μ L RNase Free 双蒸水。于37 ℃ 反应15 min, 然后于85 ℃灭活5 s, 短暂离心后置-20 ℃ 保存。

四、荧光定量PCR

用试剂盒中定量PCR部分进行荧光定量PCR扩增。扩增仪为ABI 7000 PRISM 荧光定量PCR仪(美国应用生物系统公司)。反应体系为50 μ L, 包括25 μ L Premix Ex TaqTM 溶液, 正向与反向引物各1 μ L(终浓度为0.2 μ mol/L), 荧光探针溶液2 μ L(终浓度为0.2 μ mol/L), ROX Reference Dye 1 μ L, cDNA模板5 μ L及灭菌蒸馏水15 μ L。按如下程序进行扩增:95 ℃ 30 s预变性, 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 31 s, 扩增45循环。为了消除RNA提取、逆转录等标本制备步骤各标本间的效率差异, 用双标准曲线法对血浆及外周血单个核细胞Lunx mRNA进行相对定量。按照试剂盒说明书将扩增后的产物T-A克隆至pMD-18 载体质粒中, 经转化、筛选等步骤后提取质粒DNA。将标准质粒按10∶ 1的比例依次梯度稀释至1× 108~1× 102拷贝/mL, 与标本同步进行PCR扩增。分别对各标本Lunx及内参基因β -actin定量, 以Lunx与β -actin的定量比值“ Lunx/β -actin” 进行数据分析。

五、统计学方法

运用SPSS 13.0软件, 以健康组为研究对象, 分别确定本实验室血浆与外周血单个核细胞Lunx/β -actin的分布范围, 设分布范围的上限为cut-off值, 高于此值为阳性, 不高于此值为阴性。阳性率的比较采用χ 2检验, P< 0.05为差异有统计学意义。

结 果
一、4组人群血浆Lunx/β -actin分布

本研究所采用的荧光定量PCR方法扩增Lunx与β -actin基因最低检测限为103拷贝/mL。健康人血浆Lunx/β -actin分布范围为0~0.26, 取单侧95%区间确定本实验室血浆Lunx/β -actin分布范围为0~0.22, 以其上限0.22为cut-off值, 肺癌组、肺良性疾病组、肺外肿瘤组、健康组阳性率分别为75.93%、0.00%、0.00%、4.55%。肺癌组患者阳性率显著高于肺良性疾病组(χ 2=113.10, P< 0.01)、肺外肿瘤组(χ 2=125.34, P< 0.01)和健康组(χ 2=100.33, P< 0.01), 后3组间差异无统计学意义(P均> 0.05)。Ⅰ 期、Ⅱ 期、Ⅲ ~Ⅳ 期肺癌患者血浆Lunx/β -actin阳性率分别为57.89%、67.50%、89.80%, Ⅲ ~Ⅳ 期肺癌患者阳性率显著高于Ⅰ 、Ⅱ 期肺癌患者(χ 2=7.07, P< 0.05)。见图1。

图1 4组人群血浆Lunx/β -actin分布

二、外周血中单个核细胞Lunx阳性率

肺癌组、肺良性疾病组、肺外肿瘤组及健康组外周血单个核细胞Lunx检测阳性率分别为36.11%、2.33%、0.00%、0.00%。肺癌组患者外周血单个核细胞Lunx阳性率高于肺良性疾病组(χ 2=32.79, P< 0.01)、肺外肿瘤组(χ 2=44.44, P< 0.01)和健康组(χ 2=44.44, P< 0.01)。Ⅰ 期、Ⅱ 期、Ⅲ ~Ⅳ 期肺癌患者阳性率分别为10.53%、17.50%和61.22%, Ⅲ ~Ⅳ 期肺癌患者外周血单个核细胞Lunx mRNA阳性率显著高于Ⅰ 、Ⅱ 期肺癌患者(χ 2=24.52, P< 0.01)。

三、血浆及外周血单个核细胞中Lunx mRNA检测对肺癌辅助诊断的价值

血浆中Lunx mRNA的表达对肺癌辅助诊断的敏感性高于外周血单个核细胞的敏感性(χ 2=36.46, P< 0.01), 阴性预测值高于外周血单个核细胞检测的阴性预测值(χ 2=16.37, P< 0.01)。见表2。

表2 血浆及外周血单个核细胞Lunx mRNA检测对肺癌辅助诊断的价值
讨 论

Lunx基因定位于20p11.1-q12, cDNA全长1 015 bp, 包含一个开放的读码框, 编码含257个氨基酸, 蛋白质的相对分子质量为26.7× 103 [8, 9], 是近年来发现的肺组织高度特异的基因。本研究采用荧光定量PCR检测肺癌患者血浆及外周血单个核细胞中Lunx的表达, 研究显示肺癌组患者血浆及外周血单个核细胞中Lunx表达的阳性率均高于肺良性疾病组、肺外肿瘤组及健康对照组, 提示两者对肺癌均有一定的辅助诊断价值, 并且血浆Lunx检测对肺癌辅助诊断的敏感性显著高于外周血单个核细胞检测的敏感性。以往的研究显示临床普遍采用的肺癌相关标志物如CEA、CYFRA-211、NSE等虽然敏感性与本研究检测血浆Lunx的敏感性相当, 但特异性却低于本研究检测的Lunx mRNA[10, 11]。

本研究显示4组人群血浆中仅有一小部分PCR未扩增出Lunx mRNA, 包括健康人在内的其他大部分人血浆中均有一定量的Lunx mRNA存在。可能因为Lunx基因在正常肺组织中亦有少量表达, 循环RNA的2个主要来源为凋亡和主动分泌, 在正常组织细胞中也同样存在[4], 因此大部分人血浆中均有少量循环Lunx mRNA存在。本研究显示多数健康人及非肺癌患者外周血单个核细胞中Lunx mRNA阳性率为0.00%, 而肺癌患者由于肿瘤组织增生, 肿瘤细胞可能会脱落进入外周血[3], 因此肺癌患者外周血单个核细胞Lunx有一定的阳性率。血浆中的阳性率较高可能是因为游离RNA比单个细胞更易透过毛细血管壁进入外周血[12]。晚期肺癌患者由于癌组织增大并向周围浸润, 将会有更多的循环Lunx mRNA分子或肺癌细胞进入外周血[13, 14], 研究结果也证实Ⅲ ~Ⅳ 期肺癌患者血浆及外周血单个核细胞Lunx mRNA阳性率高于早期患者, 两者对肺癌的进展性均有判断价值。

肿瘤标志物检测是辅助诊断恶性肿瘤的重要组成部分。用于常规筛查的理想标志物除需取材容易、检测方便外, 还应有一定的敏感性与特异性。RT-PCR检测肺癌患者血浆Lunx mRNA, 取材简单, 其敏感性和特异性好, 能符合常规筛查的条件, 可使肺癌的筛查效率有所提高。而对于外周血单个核细胞检测Lunx, 虽然其对肺癌辅助诊断的敏感性没有血浆高, 但研究显示是反映肺癌细胞血行微转移的良好标志物[6, 7]。用患者外周血作为检查材料, 无论是血浆或是单个核细胞对肺癌的辅助诊断都有重要的意义。

The authors have declared that no competing interests exist.

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