引用本文
王永卿, 吴婵娟, 姚敏, 张应爱, 郑玲玲. 黎族心脑血管疾病患者 apo E基因多态性分析 . 2012, 27(4): 308-311
WANG Yongqing, WU Chanjuan, YAO Min, ZHANG Ying'ai, ZHENG Lingling.. Study on the apo E gene polymorphism in Li population patients with cardiovascular and cerebrovascular disease . Labratory Medicine, 2012, 27(4): 308-311  
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黎族心脑血管疾病患者 apo E基因多态性分析
王永卿, 吴婵娟, 姚敏, 张应爱, 郑玲玲
海口市人民医院检验科,海南 海口 570208

作者简介：王永卿,男,1965年生,副主任技师,主要从事临床化学检验工作。

基金:海口市科技项目（20080000203）
摘要

目的 研究海南黎族人群心脑血管疾病载脂蛋白E( apo E)基因多态性,探讨其与心脑血管疾病之间的关系。方法 应用连接酶检测反应 (LDR)技术检测150例心脑血管疾病患者(包括高血压50例、脑梗死50例、冠心病50例)和50名健康对照者的 apo E基因多态性分布特征,并进行分析。结果 高血压组、脑梗死组、冠心病组及正常对照组均以ε3/3基因型频率最高。脑梗死组ε2等位基因频率最低,与高血压组、冠心病组和正常对照组比较差异有统计学意义( P<0.05),高血压组和冠心病组与对照组比较各等位基因差异均无统计学意义( P>0.05)。结论 apo Eε2等位基因降低可能是黎族人群脑梗死发病的重要因素。

关键词: 载脂蛋白E; 基因多态性; 心脑血管疾病; 黎族
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)04-0308-04
Study on the apo E gene polymorphism in Li population patients with cardiovascular and cerebrovascular disease
WANG Yongqing, WU Chanjuan, YAO Min, ZHANG Ying'ai, ZHENG Lingling.
Department of Clinical Laboratory, Haikou People's Hospital,Hainan Haikou 570208,China
Abstract

Objective To study the apolipoprotein E ( apo E) gene polymorphism in Li population patients with cardiovascular and cerebrovascular disease, and investigate the relationship of polymorphism with cardiovascular and cerebrovascular disease.Methods The ligase detection reaction (LDR) technique was used to detect apo E gene polymorphism in 150 patients with cardiovascular and cerebrovascular disease (50 patients with hypertension, 50 patients with cerebral infarction and 50 patients with coronary artery disease) and 50 healthy controls. The results were analyzed.Results In the disease group and control group, ε3/3 genotype frequency was the highest. The ε2 allel frequency in cerebral infarction group was lower than those in hypertension group, coronary artery disease group and control group ( P<0.05). There was no statistical significance in the allels among the hypertension, coronary artery disease and control groups ( P>0.05).Conclusions The apo E ε2 allel may be a major factor to reduce the incidence of cerebral infarction in Li population.

Keyword: Apolipoprotein E; Gene polymorphism; Cardiovascular and cerebrovascular disease; Li population

载脂蛋白E(apoliporotein E, apo E) 是血浆中重要的载脂蛋白之一, 人群中具有3种纯合子基因型(ε 2/2、ε 3/3、ε 4/4)和3种杂合子基因型(ε 2/3、ε 3/4、ε 2/4)。近年研究表明, apo E结构与机能异常如高脂血症、动脉粥样硬化形成及其严重程度密切相关。我们运用连接酶检测反应 (ligase detection reaction, LDR)技术检测心脑血管疾病患者apo E基因多态性, 探讨apo E基因多态性与心脑血管疾病的关系。

材料和方法
一、研究对象

研究对象为海南省中部各市县世居黎族人群, 随机选取海口市人民医院住院和门诊的患者及健康人群。

1.心脑血管组 共150例, 男75例, 女75例, 其中高血压50例、脑梗死50例、冠心病50例, 年龄40~70岁。高血压根据1999年世界卫生组织(WHO)的高血压病诊断标准诊断, 即收缩压≥ 18.7 kPa和/或舒张压≥ 12.0 kPa, 以在3个不同时间安静状态下测量血压值的平均值为准, 排除继发性高血压、严重肝肾功能障碍及甲状腺疾病患者。脑梗死符合全国第4届脑血管疾病会议诊断标准, 经临床、头颅CT和/或磁共振成像(MRI)确诊, 排除继发性高血压、严重肝肾功能障碍及甲状腺疾病患者。冠心病(心肌梗死)诊断符合1979年WHO关于缺血性心肌病的诊断标准。

2.正常对照组 50名为五指山市医院门诊行常规体检的正常体检者, 男25名, 女25名, 排除心脑血管疾病、糖尿病、肝肾功能不全及有高血压家族史者, 年龄4070岁。

二、方法

1.人血基因组DNA的提取 采集所有对象外周静脉血5 mL, 3.8%枸橼酸钠1∶ 6抗凝, 经酚/氯仿法抽提白细胞中的基因DNA。

2.仪器与试剂 PERKIN ELMER Gene Amp聚合酶链反应(PCR) system 9600仪; MJ PTC-200 Gradient cycler PCR仪; ABI PRISM 377 DNA Sequencer测序仪; ABI PRISM 3100 DNA Sequencer测序仪; JY600+电泳系统(北京君意东方电泳设备有限公司); FR-200A全自动紫外与可见分析装置、生物电泳图像分析系统(上海复日科技有限公司); Agrose LE(上海捷倍思基因技术有限公司)。PCR系统为Qiagen hotstar Taq酶体系(酶5 U/μ L、Buffer、Q-solution、Mg2+); dNTP(2 mmol/each, promega); Axygene PCR microplate 96 well; Axygene PCR tubes(0.2 mL); Eppendorf 移液器(各量程); LDR 系统为NEB Taq DNA ligase 酶体系(酶5 U/μ L、Buffer)。

3.LDR-PCR测序分型 (1)引物序列:见表1; (2)试验体系及操作过程:引物探针的稀释根据引物和探针的相对分子质量加TE稀释至50 pmol/L作为母液; 多重PCR、LDR时各引物母液等比混合成可直接进行反应的混合溶液; PCR 反应体系(总体系20 μ L)为模板(50 ng) 1μ L、1× Buffer 2 μ L、Mg2+(3 mmol/L)、1 mmol/L dNTP 10 μ L、二甲基亚砜(DMSO) 2 μ L、1 U/μ L Taq酶0.3 μ L、0.4 μ g/μ L DNA模板0.6 μ L、dNTP[2 mmol/(L· each)]2 μ L、Q(1× )4 μ L、Primer mix 0.4 μ L; 反应条件为95 ℃ 15 min, 94 ℃ 30 s, 64 ℃ 90 s, 72 ℃ 1 min, 共35个循环, 72 ℃ 延伸7 min; 3%的琼脂糖凝胶电泳检测, 观察PCR产物的效果, 确定其作为模板在LDR中加入的量; LDR反应体系(总体系10 μ L)为1× Buffer 1 μ L、12.5 pmol/(μ L· each)Probe mix 1 μ L、2 U连接酶0.05 μ L、PCR产物(100 ng/μ L)≥ 1 μ L; 反应条件为95 ℃ 2 min, 94 ℃ 30 s, 50 ℃ 2 min, 共35个循环; 377测序电泳后Genemapper 进行数据分析。

三、统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行统计分析, 定性资料进行χ 2检验, P< 0.05为差异有统计学意义。

表1 LDR-PCR引物序列
结 果
一、apo E rs429358、rs7412 PCR结果

PCR电泳图谱见图1。

二、apo E基因各位点LDR分型

apo E基因各位点的分型截图见图2、3。

三、各组apo E基因型及等位基因分布情况

高血压组、脑梗死组、冠心病组及正常对照组均以ε 3/3基因型频率最高。脑梗死ε 2等位基因频率最低, 与高血压组、冠心病组和正常对照组比较差异有统计学意义(P< 0.05), 高血压组和冠心病组与对照组比较各等位基因差异均无统计学意义(P> 0.05)。见表2、表3。

图1 apo E基因PCR产物电泳结果(注:1~8为PCR扩增片段(8泳道有一淡的杂带); 9为DNA模版)

图2 apo E rs429358的LDR分型截图

图3 apo E rs7412的LDR分型截图

表2 apo E各基因频率分布
表3 apo E等位基因频率分布
讨 论

人apo E是一个含有299个氨基酸结合有磷脂的糖蛋白。多态性由3个等位基因(apo Eε 2、apo Eε 3、apo Eε 4)控制, 其氨基酸顺序均已测定[1], 其区别在于112位半胱氨酸和158位的精氨酸的互换, 构成6种不同的基因型。不同国家民族人群的apo E等位基因频率分布有差异, 在3种常见的等位基因中, ε 3频率最高, ε 2和ε 4频率最低。中国人群ε 2、ε 3、ε 4频率分别为5.3%、88.4%、6.3%[2]。本研究显示黎族人群ε 2、ε 3、ε 4频率分别为9%、76%、15%, ε 2和ε 4频率都高于汉族和其他少数民族。正常对照组和心血管病患者apo Eε 3/ε 3和apo Eε 3/ε 4基因型最常见(78%~94%)。脑梗死组与正常对照组比较, apo Eε 2较低(P< 0.05), 所以失去apo Eε 2对心脑血管有保护作用, 可能是黎族人群脑梗死的发病原因。高血压组和冠心病组与正常对照组比较各等位基因差异均无统计学意义, 可见心血管疾病的发病并不完全与apo E基因多态性有关, 而与吸烟、高血压、特别是生活习惯密切相关, 近10年来我国心血管疾病发病率急增印证了这点, 这与国外有关研究[5]相符, 但与周正艳等[3]的研究结果不完全相符。

apo E参与脂蛋白转化和代谢过程。在胆固醇和甘油三酯代谢中起关键/或核心作用, 与高脂蛋白血症及动脉粥样硬化的发生、发展密切相关[6]。apo E对脂质在细胞内代谢和分布的过程有重要调节作用, 从而对细胞内脂质过氧化产生影响。apo E通过与低密度脂蛋白受体(LDL-R)和肝apo E受体结合, 促进乳糜微粒(CM)、低密度脂蛋白(LDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)的降 解。Wersgraber等研究证实, apo E2与LDL受体(LDL-R)的亲和力仅有正常apo E3的1%~2%。由于apo E2与LDL-R亲和力低, 代偿性LDL-R合成增加, LDL和VLDL清除增加, 故对心脑血管有保护作用。

本研究通过对黎族人群心血管疾病患者apo E基因多态性与正常人的比较, 从而了解黎族人群心血管疾病的主要致病因素。有利于指导药物的选择和使用, 可以有针对性地制定个体化预防、保健方案。对于患者的早期诊断、早期治疗、早期干预具有重要的意义。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Hixson JE, Vernier DT. Restriction isotyping of human apolipoprotein E by gene amplification and cleavage with Hha I[J]. J Lipid Res, 1990, 31(3): 545-548. [本文引用:1]
[2] 谢玲, 赖仁胜, 李七一, 等. 江苏汉族人群心脑血管疾病患者载脂蛋白E基因研究[J]. 南京医科大学学报(自然科学版), 2006, 26(7): 505-508. [本文引用:1]
[3] 周正艳, 符喜南, 苏庆杰, 等. 海南黎族Apo E基因多态性与脑梗死的关系[J]. 重庆医学, 2009, 39(22): 2822-2824. [本文引用:1]
[4] 赵晓涛, 张正, 贾玫, 等. 心脑血管疾病患者的载脂蛋白E基因多态性与血脂水平相关性[J]. 中国民康医学, 2006, 18(3): 88-91. [本文引用:1]
[5] Marrzoq LF, Sharif FA, Abed AA. Relationship between Apo E gene polymorphism and coronary heart disease in Gaza Strip[J]. J Cardiovasc Dis Res, 2011, 2(1): 29-35. [本文引用:1]
[6] 韩旭, 李七一, 赖仁胜, 等. ApoE基因多态性与冠状动脉粥样硬化性心脏病中医证型的相关性研究[J]. 中华中医药学刊, 2009, 25(11): 2323-2330. [本文引用:1]