引用本文
缪应新, 甘洁民, 施泓, 陈洁, 周晓倩, 赵虎. 上海地区汉族人群神经肽Y基因T1128C多态性的检测. 2012, 27(4): 304-307
MIAO Yingxin, GAN Jiemin, SHI Hong, CHEN Jie, ZHOU Xiaoqian, ZHAO Hu. The polymorphism determination of T1128C in neuropeptide Y gene among Han population in Shanghai. Labratory Medicine, 2012, 27(4): 304-307  
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上海地区汉族人群神经肽Y基因T1128C多态性的检测
缪应新, 甘洁民, 施泓, 陈洁, 周晓倩, 赵虎
复旦大学附属华东医院检验科,上海 200040

作者简介：缪应新,女,1969年生,硕士,副主任技师,主要从事分子生物学检验工作。

摘要

目的 了解上海地区汉族人群中神经肽Y( NPY)基因信号肽部位 T1128C(Leu7Pro)单核苷酸多态性(SNP)的分布频率。方法 利用聚合酶链反应(PCR)-连接酶检测反应(LDR)技术检测了867例上海地区汉族人群的 NPY基因多态性。参照待测多态性位点所在DNA序列设计并合成1对引物及3条探针,先通过PCR获得含有待检测突变位点的基因片段,再进行PCR产物的LDR,根据测序电泳结果所显示的含荧光标记的LDR产物的片段长度来判断基因型别。结果 867例研究对象均显示 NPY基因型为T1128T(Leu7Leu),未出现T1128C(Leu7Pro)或C1128C(Pro7Pro)。结论 NPY基因多态性存在明显的种族和地理差异,上海地区汉族人中不存在 NPY T1128C(Leu7Pro)基因多态性, NPY基因T1128C多态性与上海地区汉族人群冠心病的发生、发展无相关关系。

关键词: 神经肽Y基因; 单核苷酸多态性; 聚合酶链反应; 连接酶检测反应
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)04-0304-04
The polymorphism determination of T1128C in neuropeptide Y gene among Han population in Shanghai
MIAO Yingxin1, GAN Jiemin1, SHI Hong1, CHEN Jie1, ZHOU Xiaoqian1, ZHAO Hu1
Department of Clinical Laboratory, Huadong Hospital, Fudan University, Shanghai 200040,China
Abstract

Objective To investigate the distribution frequency of T1128C (Leu7Pro) single-nucleotide polymorphism (SNP) in neuropeptide Y (NPY) gene among Han population in Shanghai.Methods Polymerase chain reaction (PCR)-ligase detection reaction (LDR) was performed to detect the T1128C polymorphism in NPY gene among 867 Han people in Shanghai. A pair of primers and 3 probes were designed according to target DNA sequence. The LDR was performed after PCR amplification, and the genotypes were analyzed according to the length of fragments of LDR products on a sequencer by electrophoresis.Results All 867 subjects showed T1128T(Leu7Leu) but no T1128C(Leu7Pro) or C1128C(Pro7Pro) in the NPY gene.Conclusions There is difference of T1128C polymorphism in NPY gene among populations with different genetic and geographic backgrounds. There is no T1125C (Leu7Pro) polymorphism in NPY gene among Shanghai Han population. There is no correlation of T1128C polymorphism in NPY gene with coronary heart disease among Shanghai Han population.

Keyword: Neuropeptide Y gene; Single-nucleotide polymorphism; Polymerase chain reaction; Ligase detection reaction

神经肽Y(neuropeptide Y, NPY)是下丘脑神经元合成并释放的一种由36个氨基酸组成的神经递质, 通过调节NPY受体的活性而发挥多种生物学效应, 在调节食欲、能量平衡、神经内分泌系统和心血管循环系统方面起重要作用。人NPY基因位于染色体7q15.1, 长551 bp 。Karvonen等[1]和Uusitupa等[2]于1998年发现在NPY基因的信号肽部位存在1128位碱基T→ C的变异(T1128C), 此变异导致第7密码子编码的亮氨酸(Leu7Leu)→ 脯氨酸(Leu7Pro或Pro7Pro), 并发现NPY Pro7变异是影响血清胆固醇代谢和颈动脉粥样硬化形成[3]的强基因因子; 在芬兰一项随访966例中年男性达4年的大样本研究中发现NPY Pro7变异是加速动脉粥样硬化形成、血压升高和血清总胆固醇增高的一个重要的危险因子[4]。Wallerstedt等 [5]对1 032例瑞典高血压患者的研究发现Pro7变异是心肌梗死和脑卒中的独立预测因子; 在儿童中的研究也发现血清甘油三酯浓度、低密度脂蛋白胆固醇浓度与NPY Leu7Pro多态性相关[6, 7]。Kakko等[8]与Jaakkola等[9]近期对2型糖尿病患者的研究表明NPY Pro7变异与患者血中炎症细胞活性及炎性物质的浓度升高相关, 而后者与血管粥样硬化相关, 说明NPY基因多态性在血管粥样硬化的形成机制上有可能起作用。印度人的研究也表明NPY基因多态性与高血压相关[10]。但NPY基因T1128C多态性存在明显的种族和地理差异。本研究拟选择大样本人群, 采用连接酶检测反应(LDR)技术检测NPY基因T1128C多态性, 以了解在中国上海地区汉族人群中此基因多态性的分布频率, 并进一步了解此基因多态性与冠心病是否关联。

材料和方法
一、研究对象

研究标本取自2009年1月至2010年12月在复旦大学附属华东医院心内科行选择性冠状动脉造影的867例无血缘关系的汉族患者, 术前空腹4 h以上, 手术开始时抽取股动脉血1 mL, 置乙二胺四乙酸抗凝管中, -80 ℃保存。其中冠心病组(1支及1支以上主要血管直径狭窄≥ 50%)604例, 平均年龄(70.10± 6.93)岁; 对照组263例, 平均年龄(71.02± 7.11)岁。有以下情况之一予以剔除:心肌病、瓣膜病、全身免疫性疾病、肿瘤、严重肝肾功能不全。经统计学分析2组年龄、性别、体重指数等均具可比性(P> 0.05)。

二、仪器和试剂

1.主要试剂 UNIQ-10柱式血液基因组DNA抽提试剂盒(上海生工生物工程有限公司); 热启动Taq酶(Qiagen公司); dNTP(promega公司); DNA连接酶体系(NEB公司), 引物和探针由上海生工生物工程有限公司合成。

2.主要仪器 基因扩增聚合酶链反应(PCR)系统9600(PERKIN ELMER公司); MJ PTC-200 Gradient cycler(梯变循环仪); PRISM 377DNA测序仪(ABI公司); JY600+电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司); 生物电泳图像分析系统(上海复日科技有限公司)。FR-200A全自动紫外与可见分析装置。

三、方法

1.基因组DNA抽提 抗凝全血用红细胞裂解液裂解后用蛋白酶K(20 mg/mL)消化, 与无水乙醇混匀后转移至UNIQ-10柱中, 用洗液冲洗2次后用洗脱液(pH值8.5)洗脱, 保存在-20 ℃备用。

2.PCR扩增包含单核苷酸多态性(SNP)位点片段 用生物学软件primer3设计引物和探针, primer 1: 5'-CAGCGCCGAGTAGTATCTGG-3'; primer 2:5'-GCAGAGGAGGGAGGTGCT-3'。通用探针:P-GGGGCTGTCCGGACTGACCCTCGCCTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTT-FAM; 特异探针T:5'-TTTTTTT TTTTTTTTGATGCTAGGTAACAAGCGACT-3'; 特异探针C: 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTGATGCTAGGT AACAAGCGACC-3'。 20 μ L PCR反应体系中包含有0.6 μ L 3 mmol/L Mg2+, 1 μ L 50 ng/μ L DNA模板, 2 μ L dNTP(20 mmol/L), 0.3 μ L Taq酶(5 U/μ L), 0.4 μ L引物(5 pmol/L)混合液等。PCR反应程序为:95 ℃ 15 min预变性, 然后94 ℃ 30 s, 56 ℃ 1 min 30 s, 72 ℃ 1 min, 共35个循环, 最后72 ℃延伸7 min; 取2 μ L PCR反应产物在3%琼脂糖凝胶上电泳, 检测反应是否成功, 确定其作为模板在LDR中加入的量。剩余产物保存于-20 ℃。

3.PCR产物的LDR 在10 μ L LDR体系中包括1 μ L 探针混合液(0.5 mmol/L), 0.05 μ L连接酶(40 U/μ L), 1 μ L PCR产物等, 在基因扩增PCR系统9600上进行连接反应, 反应程序为:95 ℃预变性2 min, 再94 ℃ 30 s, 50 ℃ 2 min, 共35个循环。

4.LDR产物的检测 各取1 μ L LDR连接产物与1 μ L ABI GS-500ROX荧光标记相对分子质量标准和1 μ L去离子甲酰胺上样液混合, 95 ℃加热变性2 min, 冰中骤冷, 于5%聚丙烯酰胺和5 mol/L尿素中3 000 V电泳2.5 h, 应用GENESCANTM672软件进行数据收集、泳道线校正、迁移片段大小测量和校正内在相对分子质量标准, 应用Genemapper软件进行数据分析和基因分型。

结 果
一、PCR扩增产物

包含NPY基因Leu7Pro(T1128C)多态性位点的PCR产物长度为231 bp, 图1所示为PCR扩增产物经3%琼脂糖凝胶电泳图谱。

图1 PCR扩增产物经3%琼脂糖凝胶电泳图谱

二、SNP各种基因表型结果

根据LDR反应产物测序电泳结果的片段长度判断各基因型, 纯合子只有1种片段长度, 杂合子却包含2种纯合子的片段长度。根据所设计的探针, T基因型的片段长度为150 bp, G基因型的片段长度为152 bp。经检测, 本研究867例研究对象均显示为TT型, 未出现多态性, 图2显示了LDR产物经测序仪电泳的峰型图。

图2 LDR产物经测序仪电泳的峰型图(注:由于本试验采用的毛细管电泳替代平板电泳, 其信号较之平板电泳均向左移约2 bp, 所以在上图中各个位点信号与其理论信号位置有所偏移(2个空档表明没有出现另1种纯合子和杂合子的峰型图)

讨 论

SNP是人类可遗传变异中最常见的一种, 占所有已知多态性的90%以上, 人基因组平均每1 000个碱基中就有1个SNP。NPY基因的信号肽部位的1128位碱基T置换为碱基C, 此变异位于编码区, 直接导致第7密码子编码的亮氨酸变为脯氨酸, 使得NPY的结构发生变化, 从而影响NPY的运输和分泌, 这种功能性变异会产生基因多效性, 成为1个预测心血管疾病及多种代谢性疾病的强烈的独立的危险因子[11, 12]。

本研究所用的SNP检测方法是先通过PCR获得含有待检测突变位点的基因片段, 然后对PCR扩增产物进行LDR, LDR是利用高温连接酶实现对基因多态性位点的识别, 最后根据测序仪的电泳峰型图区分基因类型, 2个峰的为杂合子, 只有1个峰的为纯合子, 不同的片段长度对应不同的纯合子, 简单易判定, 结果准确。近来也有报道LDR用于检测PIP5K2A基因多态性[13]和乙型肝炎病毒(HBV)拉米夫定耐药突变株的检测[14]。

Ding[15]发现NPY Pro7变异在具欧洲血统和以色列人群中平均达到4%, 在北欧人群中最高, 存在由北向南递减的趋势。在芬兰人群中NPY Pro7变异达14%, 荷兰人群中为6%[1, 2]。而在102例日本人[16]、242例韩国人[17]中均未发现Pro7变异, 304例中国山东[18]冠心病患者中仅存在1例T1128C (Leu7Pro)基因型。这也许由于亚洲人群中发生NPY T1128C (Leu7Pro)基因多态性的频率本来就低, 故应加大样本量进行研究, 在印度人群中的研究就说明了这一点。Bhaskar等[19]选择了包含14个民族的654名印度人进行研究, 结果发现Pro7变异频率明显高于以往的研究结果, 并且存在明显的地理及民族差异。

本试验的研究对象为867例上海地区汉族人, 研究结果表明上海地区汉族人中不存在NPY Leu7Pro基因多态性, NPY基因T1128C多态性与上海地区汉族人冠心病的发生、发展无相关关系。但因为NPY基因多态性存在种族和地理差异, 有必要对我国其他地区和种族人群进一步进行取样研究。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Karvonen MK, Pesonen U, Koulu M, et al. Association of a leucine(7)-to-proline(7) polymorphism in the signal peptide of neuropeptide Y with high serum cholesterol and LDL cholesterol levels[J]. Nat Med, 1998, 4(12): 1434-1437. [本文引用:2]
[2] Uusitupa MI, Karvonen MK, Pesonen U, et al. Neuropeptide Y: a novel link between the neuroendocrine system and cholesterol metabolism[J]. Ann Med, 1998, 30(6): 508-510. [本文引用:2]
[3] Niskanen L, Karvonen MK, Valve R, et al. Leucine 7 to proline 7 polymorphism in the neuropeptide Y gene is associated with enhanced carotid atherosclerosis in elderly patients with type 2 diabetes and control subjects[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2000, 85(6): 2266-2269. [本文引用:1]
[4] Karvonen MK, Valkonen VP, Lakka TA, et al. Leucine 7 to proline 7 polymorphism in the preproneuropeptide Y is associated with the progression of carotid atherosclerosis, blood pressure and serum lipids in Finnish men[J]. Atherosclerosis, 2001, 159(1): 145-151. [本文引用:1]
[5] Wallerstedt SM, Skrtic S, Eriksson AL, et al. Association analysis of the polymorphism T1128C in the signal peptide of neuropeptide Y in a Swedish hypertensive population[J]. J Hypertens, 2004, 22(7): 1277-1281. [本文引用:1]
[6] Karvonen MK, Ruottinen S, Koulu M, et al. Nutrient intake, weight, and Leu7Pro polymorphism in prepro-neuropeptide Y in children[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2006, 91(11): 4664-4668. [本文引用:1]
[7] Salminen M, Lehtimaki T, Fan YM, et al. Leucine 7 to proline 7 polymorphism in the neuropeptide Y gene and changes in serum lipids during a family-based counselling intervention among school-aged children with a family histroy of CVD[J]. Public Health Nutr, 2008, 11(11): 1156-1162. [本文引用:1]
[8] Kakko T, Jaakkola U, Raitakari OT, et al. Inflamma-tory effects of blood leukocytes: association with vascular function in neuropeptide Y proline 7-genotyped type 2 diabetes patients[J]. Diab Vasc Dis Res, 2011, 8(3): 221-228. [本文引用:1]
[9] Jaakkola U, Kakko T, Seppala H, et al. The Leu7Pro polymorphism of the signal peptide of neuropeptide Y (NPY) gene is associated with increased levels of inflammatory markers preceding vascular complications in patients with type 2 diabetes[J]. Microvasc Res, 2010, 80(3): 433-439. [本文引用:1]
[10] Bhaskar LV, Thangaraj K, Non AL, et al. Neuro-peptide Y gene functional polymorphism influences susceptibility to hypertension in Indian population[J]. J Hum Hypertens, 2010, 24(9): 617-622. [本文引用:1]
[11] Mitchell GC, Wang Q, Ramamoorthy P, et al. A common single nucleotide polymorphism alters the synthesis and secretion of neuropeptide Y[J]. J Neurosci, 2008, 28(53): 14428-14434. [本文引用:1]
[12] Pesonen U. NPY L7P polymorphism and metabolic diseases[J]. Regul Pept, 2008, 149(1-3): 51-55. [本文引用:1]
[13] He Z, Li Z, Shi Y, et al. The PIP5K2A gene and schizophrenia in the Chinese population—a case-control study[J]. Schizophr Res, 2007, 94(1-3): 359-365. [本文引用:1]
[14] Xiao Z, Xiao J, Jiang Y, et al. A novel method based on ligase detection reaction for low abundant YIDD mutants detection in hepatitis B virus[J]. Hepatol Res, 2006, 34(3): 150-155. [本文引用:1]
[15] Ding B. Distribution of the NPY 1128C allele frequency in different populations[J]. J Neural Transm, 2003, 110(11): 1199-1204. [本文引用:1]
[16] Makino K, Kataoka Y, Hirakawa Y, et al. A Leucine(7)-to-proline (7) polymorphism in the signal peptide of neuropeptide Y was not identified in the Japanese population[J]. J Clin Pharm Ther, 2001, 26(3): 201-203. [本文引用:1]
[17] Ding B, Bertilsson L, Wahlestedt C. The single nucleotide polymorphism T1128C in the signal peptide of neuropeptide Y (NPY) was not identified in a Korean population[J]. J Clin Pharm Ther, 2002, 27(3): 211-212. [本文引用:1]
[18] Jia C, Liu Z, Liu T, et al. The T1128C polymor-phism of neuropeptide Y gene in a Chinese population[J]. Arch Med Res, 2005, 36(2): 175-177. [本文引用:1]
[19] Bhaskar LV, Thangaraj K, Shah AM, et al. Allelic variation in the NPY gene in 14 Indian populations[J]. J Hum Genet, 2007, 52(7): 592-598. [本文引用:1]