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黄骥斌, 曾婷婷, 郭曼英, 韩秀华, 江虹. CellaVision DM96自动化数字图像分析系统进行白细胞分类的临床应用. 2012, 27(4): 299-303
HUANG Jibin, ZENG Tingting, GUO Manying, HAN Xiuhua, JIANG Hong.. Clinical application of white blood cell differentiation of CellaVision DM96 system. Labratory Medicine, 2012, 27(4): 299-303  
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CellaVision DM96自动化数字图像分析系统进行白细胞分类的临床应用
黄骥斌, 曾婷婷, 郭曼英, 韩秀华, 江虹
四川大学华西医院实验医学科,四川 成都 610041

作者简介：黄骥斌,男,1984年生,学士,技师,主要从事临床血液学检验工作和研究。

通讯作者：江虹,联系电话：028-85422613。

摘要

目的 对CellaVision DM96自动化数字图像分析系统(简称DM96)的临床性能进行验证及评价。方法 选取422例外周血样本经自动涂片染色后,采用DM96进行白细胞分类,运用线性回归方法分析仪器结果与人工镜检结果的相关性;计算基于自带参考细胞库和扩充的参考细胞库DM96分析软件预分析识别细胞符合率;计算检出率,分析采集110、210、310、410个细胞时仪器识别具有重要临床意义细胞的能力;统计仪器分类与人工镜检所花费的时间。结果 经过线性回归分析,中性粒细胞和淋巴细胞的仪器分析结果与人工镜检结果相关系数较大(0.91和0.88),而单核细胞的相关系数较小(0.31); DM96分析软件预分析识别早、中、晚幼粒细胞、原始细胞和变异淋巴细胞的符合率从基于自带参考细胞库的27.56%、37.96%、41.85%、45.12%、29.76%提高到基于扩充参考细胞库的33.23%、56.86%、48.33%、58.08%、31.25%;分析110、210、310、410个细胞中具有重要临床意义细胞检出率分别为87.50%、92.65%、94.85%、97.59%;人工镜检花费(2.50±0.41) min/例,而仪器分析花费(1.98±0.20) min/例,人工审查确认预分析结果花费(0.91±0.14) min/例;使用初始参考细胞库和扩充参考细胞库分析所需时间分别为(2.01±0.39)和(2.09±0.54)min/例,而随着系统分析细胞数量增多分析所花费的时间显著延长。结论 DM96对白细胞分类的自动化和标准化具有较好的临床应用价值。

关键词: 外周血细胞分析; 分类; 实验室自动化; 性能评价
中图分类号:R446.11 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)04-0299-05
Clinical application of white blood cell differentiation of CellaVision DM96 system
HUANG Jibin, ZENG Tingting, GUO Manying, HAN Xiuhua, JIANG Hong.
Department of Clinical Laboratory, West China Hospital, Sichuan University, Sichuan Chengdu 610041, China
Abstract

Objective To verify and evaluate the performance of CellaVision DM96 system (DM96).Methods A total of 422 peripheral blood samples were collected and prepared by automated smear and stain system, and then analyzed by DM96 white blood cell differentiation. The results of white blood cell differentiation by DM96 were compared with those by manual microscopy. The correlation of the results by DM96 and manual microscopy was analyzed by linear regression analysis. The coincidence rate of identifying cells based on original and enlarged reference cell libraries was calculated. The ability to identify important abnormalities through analyzing 110, 210,310 and 410 cells and the time cost were calculated.Results The correlation coefficients of neutrophils and lymphocytes were 0.91 and 0.88 between DM96 and manual microscopy respectively, while the correlation coefficient of monocytes was only 0.31. DM96 agreed 27.56%, 37.96%, 41.85%, 45.12% and 29.76% for pre-differentiation of promyelocytes, myelocytes, metamyelocytes , blast cells and variation lymphocytes based on original reference cell library, and 33.23%, 56.86%, 48.33%, 58.08% and 31.25% based on enlarged reference cell library. The ratios of identifying important abnormalities were 87.50%, 92.65%, 94.85% and 97.59% when analyzing 110, 210, 310 and 410 cells. It took (2.50±0.41) min per case by manual microscopy, (1.98±0.20) min per case by DM96 and (0.91±0.14) min per case by manual confirming. Time costs of analyzing based on original and enlarged reference cell libraries were (2.01±0.39) and (2.09±0.54) min per case. With the numbers of analyzed cells increasing, time costs increased simultaneously.Conclusions The clinical application of DM96 could improve the automatization and standardization of white blood cell differentiation.

Keyword: Peripheral blood cell analysis; Differentiation; Laboratory automation; Performance evaluation

白细胞分类计数已经发展了100多年, 至今仍是实验室常用的具有重要临床价值的检查方法之一[1]。随着各种新的血液分析计数仪器和方法的不断产生, 对于正常或仅有细胞数量异常的样本, 血液分析仪已能给临床提供足够可靠的结果, 可替代传统的显微镜检查[2]。但对于有形态异常细胞或者原始幼稚细胞的样本, 检测结果需依赖于显微镜检查。所以, 显微镜检查仍是目前白细胞分类无可替代的经典方法。CellaVision DM96自动化数字图像分析系统(简称DM96)采用与血液分析仪的流式细胞术完全不同的技术, 是一种结合传统显微镜检查和现代神经网络技术的新型细胞分析技术, 用于血细胞形态分析, 其优势在于仪器能通过标准化的工作辅助人工镜检, 筛查异常血涂片, 甚至经完善后能够替代人工镜检。且其细胞图像完整保存于数据库, 有利于满足后期复查、教学等多方面的需求。该仪器目前在我国临床应用较少, 我们对DM96临床使用做了评估。

材料和方法
一、材料

1. 样本 随机选取2010年11月4日至2011年1月21日于四川大学华西医院体检中心进行健康体检的血常规样本200例、门诊或住院患者的血常规样本222例, 共422例。患者样本包括急慢性炎症、细菌或病毒感染、寄生虫或过敏性疾病、再生障碍性贫血、急慢性白血病及严重贫血患者的外周血样本。

2. 仪器 DM96(CellaVision AB公司生产); XE-2100血液分析仪(日本Sysmex公司生产)和SP-1000i自动涂片染色仪(日本Sysmex公司生产); Alphaphoto-2 YS2双目生物显微镜(日本Nikon公司生产)。

3. 试剂 各仪器均使用原装配套试剂(日本Sysmex公司生产)和质控物; 瑞氏-吉姆萨染液购自珠海贝索生物技术有限公司。

二、方法

1. 样本准备 样本统一编号, 采用SP-1000i自动化涂片染色仪涂片及染色。整个样本收集和准备的过程应在4 h内完成。自动化涂片染色仪采用空气干燥和瑞氏-吉姆萨染色。

2. DM96工作原理及方法 DM96由涂片扫描装置和装有CellaVision血细胞分析软件的计算机组成。外周血涂片装载到该系统后, 仪器开始扫描涂片, 先在10× 物镜下以城垛跟踪方式找到白细胞的单细胞层并锁定, 再于100× 物镜下通过自动对焦进行细胞分割和提取, 拍摄数码照片, 用基于人工神经网络系统(artificial neutral networks, ANN)的软件进行分析, 识别各种白细胞, 得到白细胞分类计数的预分析结果。预分析白细胞的数码照片通过电脑显示器展现在操作者面前, 操作者可以选择接受或修改结果, 通过人工审查后输出DM96的最终结果(下称“ 仪器最终结果” )。见图1。

图1 DM96工作界面

3. 人工镜检 人工镜检由2位具备资格的检验人员(工作年限超过15年, 中级或以上技术职称), 按照美国临床实验室标准化协会(CLSI)H20-2A[3]规定的方法步骤, 分别对同一血涂片在显微镜下分类100个白细胞, 共分类200个细胞。

4. 扩充参考细胞库 经过具备资质的2位检验人员讨论确认的典型形态细胞方可加入参考细胞库。

5. 性能评价 (1)仪器最终结果与人工镜检结果的相关性; (2)基于自带参考细胞库和扩充的参考细胞库的DM96预分析识别细胞的能力; (3)增加分析细胞数量后DM96识别具有临床重要意义细胞的能力; (4)DM96分析所需时间的统计。

三、统计学方法

统计分析采用Excel(Microsoft Office 2010, Microsoft Inc., Redmond, US)和SPSS(SPSS 18.0, SPSS Inc., IBM, Chicago, US)软件。计量资料采用 x-± s表示。人工结果与仪器结果的相关性采用线性回归分析, 预分析识别细胞能力采用符合率(人工同意DM96预分析结果的细胞数/预分析细胞数), DM96对具有重要临床意义细胞的检出能力采用检出率(人工镜检阳性且DM96结果也为阳性样本数/人工镜检阳性样本数)、漏检率(人工镜检阳性而DM96结果为阴性样本数/人工镜检阳性样本数)等指标。采用双侧检验, P< 0.05表示差异有统计学意义。

结 果
一、仪器最终结果与人工镜检结果的相关性

将422例仪器分类最终结果与人工镜检分类结果进行相关分析和线性回归分析, 结果见图2。其中中性粒细胞和淋巴细胞的相关系数较大(0.91和0.88, P< 0.01), 而单核细胞的相关系数较小(0.31, P< 0.01)。

图2 直接镜检与仪器最终结果的散点图

二、基于自带和扩充的参考细胞库的DM96预分析识别细胞能力

在使用自带参考细胞库对200名健康体检者和222例患者样本进行预分析后, 检验人员审查所有细胞数字图片, 人工同意预分析结果的比例见表1, 总的符合率为88.38%, 其中淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和有核红细胞的预分析符合率均在90%以上, 中性粒细胞和单核细胞的预分析符合率也较高(> 70%), 原始、幼稚阶段粒细胞及变异淋巴细胞的预分析符合率较低(< 50%)。

该仪器在本室运行期间, 发现采用初始细胞库的预分析结果不能满足我室的工作需要, 尤其是对一些具有重要临床意义的细胞。结合我室临床标本的实际情况, 我们在使用的最初34个月里, 不断充实参考细胞库内的参考细胞, 目前的每类参考细胞数量由最初的约10个增加到目前的3080个, 新加入的细胞主要为幼稚和原始细胞。之后, 我们采用新的参考细胞库对222例患者样本进行分析, 其识别具有重要临床意义细胞的能力见表2。与使用初始参考细胞库相比, 幼稚粒细胞、原始细胞和变异淋巴细胞的分析符合率均有一定程度的提高。其中主要分类错误的细胞为:将单核细胞分类为早幼粒细胞81个; 将中性中幼粒细胞分类为早幼粒细胞53个; 将中性分叶核细胞分类为中性晚幼粒细胞35个; 将单核细胞分类为中性晚幼粒细胞35个; 将早幼粒细胞分类为原始细胞177个; 将中性晚幼粒细胞分类为原始细胞101个; 将淋巴细胞分类为变异淋巴细胞68个。

表1 基于自带参考细胞库DM96预分析识别细胞能力
表2 基于扩充的参考细胞库DM96预分析识别细胞能力
三、增加分析细胞数量后DM96识别具有临床重要意义细胞的能力

我们测试了DM96识别具有临床重要意义细胞的能力。具有重要临床意义细胞的阳性判断标准为:早幼粒细胞+中性中幼粒细胞> 1%、中性晚幼粒细胞> 2%、原始细胞> 1%、变异淋巴细胞> 5%、浆细胞> 1%、有核红细胞> 1/100个白细胞。将人工镜检作为参考方法, 每个标本分析110个白细胞时, 222例患者样本中, 异常样本检出119例, 漏检17例, 检出率为87.50%, 漏检率为12.50%。进一步查找漏检的原因, 17例样本中, 11例仅有2.5%3.5%的中性晚幼粒细胞, 且均为感染病例; 4例有核红细胞< 1个/100个白细胞; 2例将原始细胞错误的划分到变异淋巴细胞, 且比例< 1%。而分析细胞数量为210、310、410个时, 漏检的样本数量分别为10、7、4个, 检出率为92.65%、94.85%、97.59%。

四、仪器分析花费时间分析

人工镜检花费(2.50± 0.41) min/例, 而仪器分析(从将血涂片装载入仪器开始至预分析完成为止)花费(1.98± 0.20) min/例, 人工审查确认预分析结果花费(0.91± 0.14) min/例, 大大节省检验师所花费的时间。使用初始参考细胞库和扩充的参考细胞库分析花费的时间分别为(2.01± 0.39)和(2.09± 0.54) min/例。而完成分析110、210、310、410个白细胞花费的时间分别为1.98、3.09、4.15、4.68 min/例, 时间随着分析的细胞数的增加而显著延长。

讨 论

DM96使用标准化分析程序, 对于分析的区域和路径都预先做好了设定, 降低了分析区域不同造成的误差。同时, DM96预分析后所有细胞图像按照预分析结果排列于屏幕上, 因此检验人员可以很快确认或对其中认为分析结果有误的细胞重新分类。检验师认可DM96预分析细胞的总比例为89.37%, 较文献报道略高(82%)[4, 5]。与1977年美国病理学家协会(CAP)组织进行的白细胞分类研究[6]比较, DM96对淋巴细胞、嗜酸性分叶核细胞的分类能力比人工分类的能力高或相当, 其他类型细胞则稍差。

将仪器分析的最终结果与检验人员直接在显微镜下的分类结果相比较, 两者的回归系数在不同类细胞间差距很大(0.30.9), 在外周血片中出现频率低的细胞(单核细胞)相关性较差, 该结果与文献报道基本相当[7]。与不同检验师分类结果之间的相关系数[8]相比, DM96与人工分类结果的相关系数在中性分叶核粒细胞、嗜碱性分叶核细胞和淋巴细胞中较高。

在DM96临床应用中发现, 参考细胞库的容量会影响细胞预分析结果的符合率。在使用扩充的参考细胞库预分析时, 具有重要临床意义细胞的分析符合率较使用初始参考细胞库时有明显的提高。由此提示, 在实际工作中需要不断完善参考细胞库以提高预分析结果的符合率。

在实际工作中, 识别样本出现具有临床重要意义的细胞, 是各种分类方法可靠性的决定性因素之一[9]。如何提高检出率、降低漏检率的发生是各种方法着力探讨的问题之一。经过试验证实, 增加DM96分类的细胞数量可以有效地减少漏检的发生, 但是并不是无限的增大细胞后漏检就能完全避免。我们发现当分类的白细胞由110个增加到410个, 具有重要临床意义的细胞漏检率明显降低(由12.5 %降低到2.41%), 而仪器分类的时间明显延长(由2.89 min/例延长到5.59 min/例)。这一点提示在临床使用DM96时, 应该根据患者的情况对系统的参数做出调整, 如遇到高危科室, 如血液科患者时, 应当适当增加分类细胞的数量, 以期提高检出率, 避免漏检。

目前DM96在国内应用较少, 多数使用过的检验人员认为该仪器拍摄的细胞图像与显微镜下直接观察到的细胞形态有一定差别, 如DM96拍摄的单核细胞图像较显微镜直接观察到的细胞颗粒更明显, 而胞核折叠感欠显著等, 这些差别使得检验人员在初次使用该仪器时判断细胞分类有一定困难。这可能是造成预分析符合率不尽如人意的原因之一。因此, 检验人员在熟悉DM96拍摄的细胞图像形态特征后可进一步提高预分析符合率。

另外在实践时间上, 人工镜检花费时间是使用DM96花费人工时间的近3倍。使用DM96时, 在血涂片装载好后仪器即开始自动预分析, 此段时间内, 检验人员可以离开进行其他工作。待其预分析完毕后, 检验人员可以在荧幕上快速对仪器已初步分类的结果进行核对和纠正。对于非急诊的样本, 可以集中审查复片结果, 从而大大节省了检验人员花费的时间, 提高了员工的工作效率。

综上所述, DM96作为一种图像分类系统, 其分类原理更接近于人工直接镜检的方法。对于外周血中数量和百分比高的细胞具有良好的辨识度, 其分类结果与人工分类相关性良好。虽然目前DM96仍然与预期有差距, 但是经过参考细胞库的完善和分类细胞数的调整可以进一步提高预分析的符合率和具有重要临床意义细胞的检出率。因此, 我们认为DM96在白细胞分类自动化和标准化上具有较好的临床应用价值。

由于单个实验室的样本及本次研究时间有限, 尽管已经进行扩展, 所应用的参考细胞库仍存在局限性, 因此多中心联合共享和丰富细胞库在未来的应用中十分必要。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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