引用本文
韩海荣, 梁颖, 赵卫国, 沈茜. 髓过氧化物酶双抗体夹心光激化学发光检测法的建立. 2012, 27(4): 291-295
HAN Hairong, LIANG Ying, ZHAO Weiguo, SHEN Qian. The establishment of double-antibody sandwich light initiated chemiluminescence assay for the determination of plasma myeloperoxidase. Labratory Medicine, 2012, 27(4): 291-295  
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髓过氧化物酶双抗体夹心光激化学发光检测法的建立
韩海荣1, 梁颖2, 赵卫国3, 沈茜1
1. 第二军医大学附属长海医院实验诊断科,上海 200433
2. 第二军医大学附属长海医院心内科,上海 200433
3. 博阳生物科技(上海)有限公司,上海 201210

作者简介：韩海荣,女,1980年生,学士,技师,主要从事自身免疫性疾病研究。

通讯作者：沈茜,联系电话：021-81873611。

摘要

目的 建立一种定量检测血浆中髓过氧化物酶(MPO)浓度的双抗体夹心光激化学发光检测法(LiCA),用于心血管疾病的辅助诊断。方法 采用棋盘格滴定法,从针对MPO抗原的12株单克隆抗体(McAb)中筛选出最佳双抗体组合(1株McAb包被发光微粒,另1株McAb进行生物素化),进而探索2种抗体最适反应浓度及MPO LiCA的最适反应条件,评价该法的重复性、敏感性、抗干扰性及回收率,并与经典的CardioMPOTM酶联免疫吸附试验(ELISA)进行平行比较分析。结果 筛选到2株最适McAb,并与链霉亲和素包被的感光微粒连接,建立用于MPO定量测定的LiCA。该法敏感性为1.76 ng/mL,批内变异系数( CV)和天间 CV分别为2.73%、3.76%,平均回收率为102.5%±8.6%,与CardioMPOTMELISA具有良好的相关性( r=0.961, P<0.01),正常参考范围为13.16128.79 ng/mL。结论 成功建立了一种用于MPO定量检测的LiCA,该法具有高的敏感性和好的稳定性,试剂有效期长,并且操作流程简便,耗时短,在心血管疾病的辅助诊断中具有很好的应用前景。

关键词: 髓过氧化物酶; 光激化学发光检测法; 酶联免疫吸附试验; 单克隆抗体
中图分类号:R446.61 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)04-0291-05
The establishment of double-antibody sandwich light initiated chemiluminescence assay for the determination of plasma myeloperoxidase
HAN Hairong1, LIANG Ying2, ZHAO Weiguo3, SHEN Qian1
1. Experiment Diagnosis Department, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China
2. Department of Cardiology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China
3.Beyond Diagnostics (Shanghai) Company Limited, Shanghai 201210, China
Abstract

Objective To establish a quantitative double-antibody sandwich light initiated chemiluminescence assay (LiCA) for the determination of plasma myeloperoxidase (MPO) concentration in order to assist to diagnose cardiovascular diseases.Methods From 12 anti-MPO monoclonal antibody (McAb), the optimum double-antibody combination (one McAb coated on luminescence particles and the other McAb conjugated with biotin) was picked out by the checkerboard titration. The suitable reaction concentration and conditions were analyzed. Consequently, the repeatability, sensitivity, anti-interference and recovery rate of the assay were evaluated and compared with the classic CardioMPOTM enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).Results Two McAbs were selected successfully. The quantitative MPO LiCA system was constructed by connecting the sensitizer particles with streptavidin. The results showed that the sensitivity was 1.76 ng/mL. The within-run and interday-run coefficients of variation ( CV) of MPO LiCA were 2.73% and 3.76% respectively, and the mean recovery rate was 102.5%±8.6%. The correlation with CardioMPOTM ELISA was high ( r=0.961, P<0.01). The normal reference range was 13.16-128.79 ng/mL.Conclusions A quantitative LiCA for the determination of MPO is successfully established. MPO LiCA with good sensitivity, stability, long reagent validity, simple and convenience shows a better application prospect in assisting to diagnose cardiovascular diseases.

Keyword: Myeloperoxidase; Light initiated chemiluminescence assay; Enzyme-linked immunosorbent assay; Monoclonal antibody

髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO) 通过增强氧化应激和氧化修饰等作用促炎、促动脉粥样硬化形成, 并影响粥样斑块的稳定性, 参与了动脉粥样斑块发展的演变过程。目前越来越多的证据表明, 血浆MPO水平对心血管疾病的早期诊断和预后评估具有特殊意义。

经典定量检测MPO的方法为酶联免疫吸附试验(ELISA), 尽管ELISA具有比较高的敏感性, 但在检测稳定性方面有待于加强, 且该法检测步骤繁琐, 耗时长, 价格昂贵, 不利于MPO在心血管疾病中的临床应用。光激化学发光检测法(LiCA)既有非常高的敏感性, 又有好的稳定性, 且测定范围宽, 试剂有效期长, 操作流程简便, 耗时短。2010年以来, 该检测技术已在西门子公司(Siemens)生产的全自动免疫化学发光检测系统中得到广泛使用, 迅速在欧美国家的医疗机构中得以推广。本研究利用发光微粒和感光微粒2种核心物质的光特性, 建立了一种新的快速定量检测血浆MPO浓度的LiCA, 并对该法的重复性、敏感性、抗干扰性及回收率等指标进行评估。

材料和方法
一、材料

发光珠标记的抗MPO单克隆抗体(McAb, 12株)、发光珠抗体稀释液、生物素化抗MPO McAb(12株)、生物素化抗体稀释液、链霉亲和素包被的感光珠、白色不透明96孔反应板、光激化学发光检测仪(LiCA HT)均由上海博阳生物科技有限公司提供; Human MPO定标品(1 mg/mL)购自GenWay Biotech.Inc; 小牛血清(MPO标准品稀释液)购自上海基星生物科技有限公司; CardioMPOTM ELISA检测试剂盒购自美国Cleveland HeartLab公司; MK3酶标仪为Thermo Scientific Multiskan产品。

二、标本来源

136份正常人血浆标本来源于身体健康、无心血管系统疾病的长海医院体检人群, 男70例, 女66例, 平均年龄(64± 15)岁, 均经心电图检查证实无明显异常, 且血脂、空腹血糖等均正常。80例明确诊断为急性冠脉综合征(ACS)并进行冠脉支架手术治疗的患者均为长海医院心内科住院患者, 在年龄和性别比例上与正常对照组无明显差异。患者在进行冠脉支架手术前采集血液标本置于含乙二胺四乙酸钾的抗凝真空采血管中, 30 min内离心分离血浆(1 600× g, 10 min), -80 ℃冻存备用。本研究中临床标本的采集经长海医院医学伦理委员会批准。

三、MPO标准品的配制

用小牛血清作为稀释液倍比稀释MPO标准品(1 mg/mL), 浓度5、10、50、100、200、500 ng/mL, 浓度的常用对数(logN)作为横坐标, 光信号的常用对数(logG)作为纵坐标, 绘制标准曲线, 小牛血清作为空白对照孔。

四、ELISA测定血浆MPO浓度

按试剂盒操作说明书进行检测。

五、LiCA测定血浆MPO浓度

用发光珠抗体稀释液稀释发光珠标记的抗体至100 μ g/mL, 用生物素化抗体稀释液稀释生物素化抗体至4 μ g/ mL。6个定标曲线标准品及待测血浆标本分别加入25 μ L到相应反应孔内, 每孔再加入25 μ L的发光珠抗体和25 μ L的生物素化抗体。把已加好的反应板放入LiCA仪中, 37 ℃温育15 min, 每孔加入LiCA通用液25 μ L, 温育15 min, 读取光信号值(孵育和检测均在LiCA HT上自动完成)。

六、统计学方法

采用 SPSS 16.0软件和Excel 2003软件对结果进行统计分析, 所有数据进行正态性检验, 采用Wiloxon符号秩检验进行分析, 以P< 0.05为差异有统计学意义。

结 果
一、抗体的筛选与最适反应条件的确定

用小牛血清倍比稀释MPO抗原标准品0、1、10、100、1 000 ng/mL, 进行棋盘格滴定法检测, 每个浓度重复测定2次, 得出其光信号值。根据信号值和信噪比(S/N)大小以及拟合的直线相关系数(R2), 得出第4株发光珠标记的抗体和第4株生物素化抗体为最佳组合, 其信号值、S/N及拟合的直线R2最高。

选用100和200 μ g/mL的第4株发光珠抗体(F4#)分别与浓度为2、4和16 μ g/mL的第4株生物素化抗体(B4#)进行组合, 综合考虑其信号值、拟合的直线R2和S/N, 得出第4株发光珠抗体浓度为100 μ g/mL和第4株生物素化抗体浓度为4 μ g/mL为最适反应浓度。

二、方法学评价试验

1. 标准曲线和敏感性 用小牛血清倍比稀释MPO标准品(1 mg/mL)至5、10、50、100、200和500 ng/mL, 浓度的常用对数(logN)作为横坐标, 光信号的常用对数(logG)作为纵坐标, 绘制标准曲线, 线性方程为Y=1.178X+2.569。用小牛血清做空白对照, 重复测定20次, 求其光信号值的平均值和标准差, 分析敏感性为与“ 0” 值校准品相区别的最低分析物浓度[1], 平均值加上2倍标准差后的光信号值在标准曲线上所得的浓度值作为该法的分析敏感性, 为1.76 ng/mL, 可测量的范围为1.76~500 ng/mL。见图1。

图1 标准曲线(注:Y=1.178X+2.569, R2=0.998)

2. 精密度 用含10、50、200 ng/mL MPO抗原的溶液各测定20孔, 其批内变异系数(CV)分别为2.41%、2.40%和3.39%。连续测定20 d, 其天间CV分别为3.76%、3.06%和4.45%, 批内平均CV为2.73%, 天间平均CV为3.76%。见表1。

表1 精密度试验结果

3. 回收试验 以回收试验来证实该检测法的特异性。将MPO浓度为56和295 ng/mL的血浆标本, 分别与MPO标准品(浓度为50、200和500 ng/mL)按体积比为9∶ 1混合, 测定其回收率分别为95.6%、93.8%、94.3%、110.0%、110.0%、111.0%, 平均回收率为102.5%± 8.6%。见表2。

表2 回收试验结果

4. Hook效应 用小牛血清稀释MPO标准品至5、10、20、25、40、50、80、100、120、150、200、250、300、350、400、500、800和1 000 ng/mL共18个浓度, 每个浓度标本重复测定4次, 计算各浓度值测定值的均数。本检测方法在MPO浓度为5~1 000 ng/mL内未见Hook效应。见图2。

图2 Hook效应

5. 干扰试验 准备3个无溶血、黄疸和脂血的新鲜混合血浆标本, MPO浓度分别为63、128和195 ng/mL, 在新鲜混合血浆标本中加入高浓度的血红蛋白(Hb), 获得干扰标本。用同样的方法加入等量的标本稀释液作为对照标本, 每个标本按照随机次序测定10次, 取干扰标本和对照标本各自测定值的均数计算百分比(干扰标本测定值/对照标本测定值× 100%), 以干扰标本的浓度为横坐标, 干扰标本与对照标本测定值的百分比为纵坐标作图, 以< 90%和> 110%作为判断干扰具有临床意义的标准, 评价Hb对检测方法的干扰。用生理盐水洗涤红细胞后, 反复冻融使细胞破裂溶血, 离心后去除沉淀, 检测其Hb浓度为53 g/L, 制备6个浓度的Hb干扰标本(10.6、5.3、3.2、2.4、2.0和1.5 g/L)进行检测, 结果表明在溶血(Hb< 3.2 g/L)时, 对检测方法的干扰无临床意义。见图3。

图3 Hb干扰试验

6. 方法学比较 80份经冠脉造影等确诊的ACS患者血浆标本, 用LiCA和ELISA分别进行检测, 以ELISA测定浓度为横坐标(X轴), LiCA测定浓度为纵坐标(Y轴), 进行线性回归分析。结果表明2种方法的检测结果相关性很好(r=0.961, P< 0.01)。ELISA检测值为横坐标(X), ELISA检测值与LiCA检测值的差值为纵坐标(Y), 绘制偏差图, 由偏差图可以看出2种方法的检测结果存在一定的偏差。方法测定值差值的均数为28.1 ng/mL, 其95%可信区间为24.132.2 ng/mL。见图4和图5。

图4 LiCA与ELISA测定血浆MPO浓度的相关性(注:Y=0.939 8X-22.176, r=0.961)

图5 LiCA与ELISA测定MPO的偏差图

7. 正常参考范围 136份健康人血浆标本进行双孔测定MPO浓度, 计算均数。男性组测定的MPO浓度范围为4.10165.90 ng/mL, 中位浓度为38.02 ng/mL; 女性组测定的MPO浓度范围为13.27125.51 ng/mL, 中位浓度33.30 ng/mL; 男性组和女性组MPO浓度值差异无统计学意义(P=0.301)。由于这136份血浆MPO浓度值经正态性检验为非正态分布, 医学参考值范围的制定通常采用百分位数法, 以2.597.5百分位值作为参考值范围, 故血浆MPO LiCA测定正常参考值范围为13.16128.79 ng/mL。

讨 论

在发达国家冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称冠心病)居于死亡原因的首位。中国冠心病的发病率和死亡率虽然较发达国家低, 但随着社会和经济的发展, 亦逐年上升, 已成为我国成人死亡的重要原因。ACS是冠状动脉易损斑块破裂或血栓形成导致的严重心肌缺血事件, 占冠心病患者总数的30 %~40 % , 是近年心血管疾病研究的热点。ACS 包括不稳定型心绞痛、非ST段抬高型心肌梗死和ST 段抬高型心肌梗死。现有研究认为, 炎症反应和易损斑块破裂互为因果, 并启动了ACS 病理生理机制的一个恶性循环过程, 在此基础上继发血栓形成, 导致了临床上的ACS。MPO 作为一种新的预测ACS 的炎症标志物, 其表达和活性升高是ACS发生的原因[2]。有文献报道, 患者基础MPO水平越高, 其短期或长期不良心血管事件的发生率越高[3]。Ndrepepa等[4]研究表明冠脉疾病从稳定型心绞痛发展为非ST段抬高型心肌梗死、急性心肌梗死的过程中伴随有MPO水平的升高, 且MPO升高水平与冠脉疾病的严重程度相关。此外, 既往研究还表明MPO与冠脉疾病具有独立的相关性, 且相关程度较超敏C反应蛋白高[4], 在心肌梗死的早期诊断方面, MPO血浆浓度升高比传统的生物标记[肌钙蛋白、sCD40L、超敏C反应蛋白等]更早, 在心肌梗死临床症状发生2 h, MPO血浆浓度即已经升高[5]。肌钙蛋白阴性的心肌梗死患者, MPO升高具有非常高的辅助诊断价值[6]。在超敏C反应蛋白水平升高的前提下, MPO> 322 pmol/L的患者比MPO≤ 322 pmol/L更容易发生主要不良心血管事件(MACEs)[7], 但也有研究发现在稳定型冠脉疾病中, 血浆MPO浓度并没有升高[8]。

LiCA主要利用了发光微粒和感光微粒2种核心物质的光特性, 当他们通过被检抗原连接形成双抗体夹心复合物时, 就拉近了2个微粒的距离(< 200 nm), 用波长为680 nm激光照射感光微粒后, 感光微粒能使周围环境中的氧转化为高能态离子氧。由于离子氧的生存时间仅为4 μ s, 短暂的生存时间决定了离子氧的传播直径很小(约200 nm)。若发光微粒在200 nm范围内接收到离子氧, 就能够发出高能级的光(610 nm); 如果在200 nm直径范围内没有发光微粒, 高能态离子氧就会回落到基态氧而没有信号产生, 这种依赖于2种微粒相互接近的化学能量传递是LiCA均相反应的基础[9]。在LiCA反应体系中, 通常微粒的浓度非常小, 2种微粒相互碰撞的概率很低, 使反应体系的本底非常微弱, 这也是优越于ELISA之处。LiCA具有高的敏感性和稳定性, 且具有测定范围宽, 试剂有效期长, 操作流程简便, 耗时短的优点。

本研究建立了一种新型的LiCA MPO检测方法, 该方法的检测敏感性为1.76 ng/mL, 批内CV为2.73%, 天间CV为3.76%, 而ELISA检测的敏感性则为2.1 ng/mL, 批内CV为6.7%, 天间CV为8.3%, LiCA MPO检测方法明显较商品化ELISA更敏感、更稳定。采用80份确诊ACS患者的血浆标本对所建立的测定MPO浓度的LiCA与经典的ELISA进行了比较, 结果证明这2种方法检测结果具有很好的相关性(r=0.961), 但存在一定的偏差。这种偏差主要与缺乏统一的MPO标准品或标准化有关, 也可能与使用的抗体所针对的抗原表位、与抗原的结合力等方面均存在差异有关。LiCA测定136份正常人血浆的MPO参考范围为13.16 128.79 ng/mL, ELISA检测MPO的正常参考范围为41.10295.20 ng/mL(试剂盒说明书), 且均无性别差异。除此之外, LiCA测定MPO还具有较好的抗干扰性、较宽的检测线性范围(Hook效应弱)、很高的检测敏感性和特异性。

总之, 本研究建立的测定血浆MPO的LiCA是一种新的、具有非常高实用价值的定量测定方法。由于目前本研究仅完成了LiCA MPO测定方法的建立和方法学评价, 其在临床上的应用价值还需大量临床标本检测结果的分析和验证。

The authors have declared that no competing interests exist.

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