引用本文
张亮, 陈志强, 文剑. 脂联素影响体外培养肝细胞乙醛氧化酶1表达的研究. 2012, 27(4): 275-279
ZHANG Liang, CHEN Zhiqiang, WEN Jian. Investigation on the influence of adiponectin on aldehyde oxidase-1 expression of hepatic cell lines in vitro. Labratory Medicine, 2012, 27(4): 275-279  
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脂联素影响体外培养肝细胞乙醛氧化酶1表达的研究
张亮1, 陈志强1, 文剑1
1.东南大学医学院附属第二医院检验科,江苏 南京 210003

作者简介：张亮,女,1962年生,学士,副主任技师,主要从事微生物学及免疫学研究。

摘要

目的 研究脂联素(APN)对饱和脂肪酸(SFA)孵育HepG2细胞及HL-7701肝细胞乙醛氧化酶1(AOX1)分泌的影响,探讨APN对非酒精性脂肪肝脏病变(NAFLD)的治疗效果及机制。方法 用100 μmol/L SFA孵育细胞得到脂肪性HepG2细胞及HL-7701细胞,同时设立细胞对照组(未经100 μmol/L SFA孵育)。然后采用不同浓度APN(0.5、1.0、1.5、2.5 μg/mL)孵育脂肪性HepG2细胞及HL-7701细胞,将未经APN孵育的细胞作为对照。运用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测2种细胞 AOX1基因表达,运用免疫印迹法检测2种细胞AOX1蛋白表达。结果 与未经100 μmol/L SFA孵育的对照组比较,经100 μmol/L SFA孵育过的HepG2细胞及HL-7701细胞的 AOX1基因及蛋白表达均明显增加( P<0.05),且HepG2细胞组明显高于HL-7701细胞组( P<0.05)。加入APN孵育细胞后,2种细胞 AOX1基因及蛋白表达均明显低于未经APN孵育的对照组( P<0.05);并且随APN浓度升高,降幅增加。当APN浓度达到1.5 μg/mL时,细胞AOX1表达的降低不再随APN浓度的增加而发生明显变化。在APN浓度相同的条件下,HepG2细胞组中 AOX1基因及蛋白表达降低的幅度明显高于HL-7701细胞组。结论 APN能有效降低脂肪化肝脏细胞 AOX1基因及蛋白表达,能很好的保护肝脏细胞,避免肝脏细胞发生NAFLD。

关键词: 脂联素; 乙醛氧化酶1; HepG2肝癌细胞株; HL-7701肝细胞株; 非酒精性脂肪肝脏病变
中图分类号:R446.1 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)04-0275-05
Investigation on the influence of adiponectin on aldehyde oxidase-1 expression of hepatic cell lines in vitro
ZHANG Liang1, CHEN Zhiqiang1, WEN Jian1
1.Department of Clinical Laboratory, Wuhan Medical Care Center for Women and Children, Hubei Wuhan 430016, China
Abstract

Objective To investigate the influence of adiponectin(APN) on aldehyde oxidase-1 (AOX1) expression of HepG2 hepatoma cell lines and HL-7701 hepatic cell lines incubated by saturated fatty acid (SFA), and discuss the curative effect and possible mechanism of APN to protect non-alcohol fatty liver disease(NAFLD).Methods Fatty HepG2 hepatoma cell lines and HL-7701 hepatic cell lines were incubated by 100 μmol/L SFA, and cells without being incubated by 100 μmol/L SFA were as controls. The fatty HepG2 hepatoma cell lines and HL-7701 hepatic cell lines were performed the treatment of APN (0.5,1.0,1.5 and 2.5 μg/mL), and cells without APN treatment were used as control group. Reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) and Western-blot were utilized to detect the expressions of AOX1 gene and AOX1 protein.Results The AOX1 gene and AOX1 protein expressions of cells incubated by 100 μmol/L SFA were significantly higher than those of controls without being incubated by 100 μmol/L SFA (P< 0.05), and the expression of HepG2 cells was significantly higher than that of HL-7701 cells (P< 0.05). The AOX1 gene and AOX1 protein expressions of cells treated by APN were reduced significantly comparing to those without APN treatment (P< 0.05), which indicated that APN could decrease the expression effectively. However, the AOX1 expression of cells had no change, when the APN concentration reached 1.5 μg/mL. The AOX1 gene and AOX1 protein expressions of HepG2 cells decreased significantly higher than those of HL-7701 cells at the same APN concentration.Conclusions APN could reduce the expression of cells incubated by saturated fatty acid effectively, therefore it could protect hepatic cells from NAFLD.

Keyword: Adiponectin; Aldehyde oxidase-1; HepG2 hepatoma cell line; HL-7701 hepatic cell line; Non-alcohol fatty liver disease

脂联素(adiponectin, APN)是目前发现的一种特定能降低肥胖患者器官脂肪化的蛋白质, 特别是能避免肝脏的非酒精性脂肪化、纤维化[1, 2, 3]。现有研究表明乙醛氧化酶1(aldehyde oxidase-1, AOX1)的活性与氧自由基相关, 而氧自由基能导致细胞发生损伤和纤维化[4, 5, 6]。本课题组前期研究表明, AOX1在非酒精性脂肪肝脏病变(non-alcohol fatty liver disease, NAFLD)细胞中大量表达[7, 8]。我们通过研究APN对体外培养肝细胞AOX1分泌的影响规律及机制, 探讨其对NAFLD的治疗效果及机制。

材料和方法
一、试剂及材料

细胞培养所用试剂RPMI 1640培养基与胎牛血清均来自Gibco公司, APN由Sigma公司提供。5%CO2培养箱为Thermo公司产品, 百级生物安全柜为Esco公司产品。逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)试剂盒为Sigma公司产品, 免疫印迹法采用ECL Western-blot 检测系统。

二、细胞培养

试验所用肝癌细胞株HepG2及肝细胞株HL-7701均购自中科院上海细胞库, 均用含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)1640培养基培养, 细胞传代时使用含5%乙二胺四乙酸(EDTA)胰蛋白酶消化细胞为细胞悬液, 并用磷酸盐缓冲液(PBS)反复洗涤3次, 用含FBS培养基重悬细胞为细胞悬液并移植进入新的培养瓶中, 细胞种植浓度> 105/mL。

三、脂肪性肝细胞模型建立及APN孵育细胞

采用饱和脂肪酸(saturated fatty acid, SFA)孵育2种肝细胞, SFA浓度为100 μ mol/L, 孵育24 h后检测AXO1在细胞中的表达。SFA孵育完成后, 将不同浓度APN加入细胞培养瓶中孵育细胞, APN浓度为0.5、1.0、1.5、2.5 μ g/mL, 与细胞共培养24 h后, 用胰蛋白酶将细胞消化成细胞悬液, 以待进一步检测。

四、实时RT-PCR

基因表达采用RT-PCR实时检测[7]。AOX1及β -肌动蛋白(β -actin)引物序列见表1。在试验过程中, AOX1用45次循环, β -actin采用40次循环。在进行PCR前, 样本均在95 ℃预处理10 min以活化Taq聚合物。循环试验参数设置为:95 ℃灭活15 s, 60 ℃处理10 s, 72 ℃处理10 s。

表1 AOX1及β -actin引物序列
五、细胞AOX1蛋白表达检测

细胞的暂时保存及洗涤都在PBS中完成。收集细胞, PBS洗涤细胞2次, 加细胞裂解液[50 mmol/L Tris-HCl(pH值8.0)、120 mmol/L NaCl、50 mmol/L NaF、200 μ mol/L钒酸钠、0.5% NP-40], 超声破碎细胞。取50 μ g蛋白用12%分离胶和5%浓缩胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。电泳电压80 V, 待样本电泳至分离胶部分后改电压为110 V。电泳完毕后, 剥离胶, 用半湿转膜仪50 mA电转2 h, 将蛋白转移到硝酸纤维素(NC)膜上, 并将膜用含3%小牛血清(BSA)的TTBS[0.1% Tween-20、10 mmol/L Tris-HCl(pH值7.5)、150 mmol/L NaCl]4 ℃封闭过夜。TTBS洗膜3次, 每次5 min, 加1∶ 250稀释的兔抗人AOX1单抗, 杂交3 h后TTBS洗膜3次, 每次5 min, 然后加碱性磷酸酶标记的1∶ 7 500稀释的抗兔二抗, 2 h后取出膜, TTBS洗3次, 每次5 min[9]。运用ECL Western-blot检测系统检测免疫复合物。

六、统计学方法

试验数据用SPSS 13.0软件进行统计分析, 数据采用 x-± s表示, 统计误差分析采用t因子分析法, P< 0.05表示差异有统计学意义。

结 果
一、AOX1在脂肪性肝细胞株中的表达

与对照组比较, 100 μ mol/L SFA孵育后HepG2及HL-7701细胞组AOX1基因及蛋白表达明显增加(P< 0.05), 且HepG2细胞组AOX1基因及蛋白的表达明显高于HL-7701细胞组(P< 0.05)。见表2、图1。

二、APN对肝细胞模型AOX1基因表达的影响

与对照组比较, 0.5、1.0、1.5、2.5 μ g/mL APN的加入能降低2种细胞中AOX1基因的表达, 且随着APN浓度的增加, 降低幅度更为明显。当APN浓度达到1.5 μ g/mL后, AOX1表达的降低不再随APN浓度的增加而发生明显变化(P> 0.05)。HepG2细胞组中AOX1基因表达的降低幅度明显高于HL-7701细胞组。见表3、图2。

表2 经100 μ mol/L SFA孵育后HepG2及HL-7701细胞组AOX1基因及蛋白表达结果

图1 RT-PCR及免疫印迹法测定100 μ mol/L SFA孵育HepG2和HL-7701细胞AOX1基因及蛋白的表达(注:a图为RT-PCR图; b图为免疫印迹电泳图; 1为HL-7701细胞对照组; 2为SFA孵育HL-7701细胞组; 3为HepG2细胞对照组; 4为SFA孵育HepG2细胞组)

表3 不同浓度APN孵育HepG2及HL-7701细胞AOX1基因表达的结果

图2 不同浓度APN孵育HepG2和HL-7701细胞AOX1基因的表达(注:1为未加APN孵育的HL-7701细胞(对照); 2~5分别为0.5、1.0、1.5、2.5 μ g/mL APN孵育HL-7701细胞; 6为未加APN孵育的HepG2细胞(对照); 7~10分别为0.5、1.0、1.5、2.5 μ g/mL APN孵育HepG2细胞)

三、APN对细胞模型AOX1蛋白表达影响

不同浓度APN孵育HepG2细胞及HL-7701细胞的AOX1蛋白表达值均低于相应对照组细胞(P< 0.05), 且随着APN浓度的升高而下降(P< 0.05)。与HL-7701细胞组相比, HepG2细胞孵育后其AOX1蛋白表达值下降更加明显。见表4、图3。

表4 不同浓度APN孵育HepG2及HL-7701细胞AOX1蛋白表达的结果

图3 不同浓度APN孵育HepG2和HL-7701细胞AOX1蛋白的表达(注:1为未加APN孵育的HepG2细胞(对照); 2~5分别为0.5、1.0、1.5、2.5 μ g/mL APN孵育HepG2细胞; 6为未加APN孵育的HL-7701细胞(对照); 7~10分别为0.5、1.0、1.5、2.5 μ g/mL APN孵育HL-7701细胞)

讨 论

NAFLD是目前一种常见的肝脏疾病, 可进展成肝纤维化、肝硬化, 甚至引起肝衰竭、肝癌等严重肝病。NAFLD与肥胖、糖耐量异常(IGT)和糖尿病、血脂异常、高血压、高胰岛素血症和胰岛素抵抗以及高瘦素血症等关系密切, 这些因素可单独或联合存在。而APN可能就是将肥胖、冠心病、糖尿病与胰岛素抵抗连接起来的桥梁。因此, 与代谢密切相关的新的内分泌激素— — APN在其发病机制中的作用日益受到人们关注。许多研究表明, NAFLD与胰岛素抵抗关系密切, 已得到动物试验的证实。有研究者发现向小鼠体内注射重组APN, 可改善胰岛素抵抗[10, 11, 12]。相反, 缺乏APN的小鼠表现出胰岛素抵抗[13]。本研究旨在探讨APN对体外培养脂肪性肝细胞模型AOX1蛋白及基因表达的影响, 并探讨APN对NAFLD的影响机制。

AOX1是一种硫化黄素蛋白木钼盐, 其活性与体内氧活性中间体(reactive oxygen species, ROS)的产生相关, ROS是酒精性肝中毒的主要表现物, 能导致细胞损伤及纤维化。因此AOX1的表达能决定临床用药对肝脏细胞的治疗效果以及治疗后ROS的分泌水平[14, 15]。本研究SFA孵育试验结果显示, 2种细胞经SFA孵育后AOX1基因及蛋白表达明显升高, 表明AOX1与肝脏细胞脂肪性病变呈明显相关。AOX1的升高会引起ROS增高进而导致肝纤维化, 但也会促进维甲酸的形成。更进一步研究表明, 在脂肪化肝脏中以上药物的代谢以及前驱药物的活性也会加强。本研究结果显示在同样的孵育条件下, HepG2细胞的AOX1表达明显高于HL-7701细胞的表达, 表明肝癌细胞更易吸收脂肪性物质而表现为脂肪性病变。

APN又称脂肪细胞补体相关蛋白30(Acrp30), 是由成熟脂肪细胞分泌的一种特有的细胞因子, 由244个氨基酸组成, 具有抗炎、抗氧化、增加胰岛素敏感性的效用[16]。RT-PCR结果表明APN能显著降低2种细胞的AOX1基因表达。免疫印迹试验结果也证明相对于对照组, APN能显著降低细胞中AOX1的表达。因此, APN能有效地保护体外培养肝脏细胞发生脂肪化。同时本研究结果表明, 相对于HL-7701细胞, APN对HepG2细胞的AOX1表达有更显著的效果。由此证明APN对肝癌细胞的保护作用更为显著, 其原因可能为HepG2细胞的生长周期为48 h, 而HL-7701细胞的生长周期为112 h。因此, HepG2细胞的物质代谢及能量代谢更为剧烈, 所需的营养物质更多。在SFA孵育细胞试验中, 在相同孵育条件下HepG2细胞中的AOX1表达更为明显。同样, 在相同APN孵育条件下, APN更容易进入HepG2细胞并对细胞产生影响。因此HepG2细胞中AOX1表达下降更为显著。其可能的分子机制为APN激活腺苷酸(AMP)激酶和过氧化物酶体增殖体激活体受体-γ (PPAR-γ )通路, 从而增加脂肪酸的β 氧化, 使甘油三酯(TG)降低。此外, 在NAFLD的发生过程中, 炎症因子以及增多的游离脂肪酸可能扮演的重要角色。而在炎症因子中肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factors-α , TNF-α )是目前研究较为热门的一个因子。TNF-α 可在多方面促进NAFLD的形成和发展[17]。

APN能很好的抑制脂肪化肝细胞AOX1的表达, 进而保护肝脏细胞避免其发生脂肪化, 并对NAFLD有较好的治疗效果, 可作为一种潜在的治疗NAFLD手段。

The authors have declared that no competing interests exist.

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