引用本文
谢耀盛, 谢海啸, 王明山, 牛真珍, 金艳慧. 静脉血栓形成患者FⅫ基因多态性对凝血纤溶功能的影响. 2012, 27(3): 213-216
XIE Yaosheng, XIE Haixiao, WANG Mingshan, NIU Zhenzhen, JIN Yanhui. Influence of factor Ⅻ polymorphism on the coagulation and fibrinolysis in patients with venous thrombosis. Labratory Medicine, 2012, 27(3): 213-216  
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静脉血栓形成患者FⅫ基因多态性对凝血纤溶功能的影响
谢耀盛, 谢海啸, 王明山, 牛真珍, 金艳慧
温州医学院附属第一医院实验诊断中心,浙江 温州 325000

作者简介：谢耀盛,男,1978年生,主管技师,主要从事临床血液学检验工作。

通讯作者：王明山,联系电话：0577-88069594。

基金:温州市科技计划资助项目（Y20070073）
摘要

目的 探讨静脉血栓形成患者凝血因子Ⅻ(FⅫ)基因多态性对凝血和纤溶功能的影响。方法 分别采用一期凝固法、免疫比浊法及发色底物法检测75例静脉血栓形成患者及60名正常对照者的血浆凝血因子Ⅻ活性(FⅫ ∶C)、纤维蛋白原(FIB)、D-二聚体(D-D)、凝血因子Ⅷ活性(FⅧ ∶C)、血管性血友病因子(VWF)、纤溶酶原活性(PLG ∶A)、抗凝血酶活性(AT ∶A)、蛋白C活性(PC ∶A)等指标。采用直接测序法测定上述研究对象的FⅫ基因启动区第46位碱基多态性。结果 静脉血栓形成患者的46TT多态性较正常对照组比例增高,46TT型患者FⅫ ∶C明显低于46CT、46CC型及正常对照组( P均<0.05);与正常对照组比较,46TT型的AT ∶A活性明显减低,而FIB、D-D、FⅧ ∶C和VWF含量明显升高( P均<0.05);但静脉血栓形成患者FⅫ多态性各型之间的上述指标差异无统计学意义( P>0.05)。FⅫ多态性各型患者及对照组之间的PLG和PC活性差异亦无统计学意义( P均>0.05)。结论 静脉血栓形成患者FⅫ基因46TT多态性明显增多而导致FⅫ活性明显下降;FⅫ基因多态性各组之间凝血和纤溶功能差异无统计学意义。

关键词: 凝血因子Ⅻ; 基因多态性; 凝血; 纤溶功能; 静脉血栓形成
中图分类号:R446.11 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)03-0213-04
Influence of factor Ⅻ polymorphism on the coagulation and fibrinolysis in patients with venous thrombosis
XIE Yaosheng, XIE Haixiao, WANG Mingshan, NIU Zhenzhen, JIN Yanhui
Department of Clinical Laboratory, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College, Zhejiang Wenzhou 325000, China
Abstract

Objective To investigate the influence of factor Ⅻ(FⅫ) polymorphism on the coagulation and fibrinolysis in patients with venous thrombosis.Methods The activity of plasma factor Ⅻ(FⅫ ∶C), fibrinogen(FIB), D-dimer(D-D), factor Ⅷ(FⅧ ∶C), von Willabrand factor(VWF), the activity of plasminogen(PLG ∶A), the activity of plasma antithrombin(AT ∶A) and the activity of protein C(PC ∶A)were measured by one-stage recalcification clotting time assay, immunoturbidimetry assay and chromogenic substrate method in 75 patients with venous thrombosis and 60 healthy controls. The 46th basyl polymorphism at promoter regions in FⅫ gene was analyzed by direct sequencing.Results The rate of 46TT polymorphism in patients with venous thrombosis was higher than that in control group, and the FⅫ ∶C of the 46TT patients was obviously lower than those of the 46CT and 46CC patients and control group( P<0.05). In 46TT group, AT ∶A was lower than that in control group,but the FIB, D-D, FⅧ ∶C and VWF were higher( P<0.05). There were no significant differences in above parameters among the various FⅫ polymorphism groups with venous thrombosis( P>0.05), and there were also no differences in PLG ∶A and PC ∶A among these groups( P>0.05).Conclusions The FⅫ gene 46TT polymorphism is obviously increased in patients with venous thrombosis, and it will cause the decreasing of FⅫ. There are no statistical significances in the parameters of the coagulation and fibrinolysis at each FⅫ polymorphism group with venous thrombosis.

Keyword: Factor Ⅻ; Gene polymorphism; Coagulation; Fibrinolysis; Venous thrombosis
引言

静脉血栓形成是由多因素作用所致的包括深静脉血栓(DVT)和肺栓塞在内的一组严重危害人类生命及健康的疾病。机体凝血纤溶功能的失衡在其发病机制中占有重要地位, 特别是凝血因子多态性(SNPs)对血栓形成的诊断预防有重要意义[1, 2]。凝血因子Ⅻ (FⅫ )的活化启动了内源凝血途径, 同时也参与纤溶途径的激活, 有研究表明FⅫ 缺乏并不引起明显的出血倾向, 相反使患者有发生血栓形成的危险, 在FⅫ 基因启动区第46位核苷酸有一多态性C> T(FⅫ 46 C> T), 其多态性可降低基因的翻译效率, 会使FⅫ 抗原含量和活性下降[3, 4]。我们对静脉血栓形成患者FⅫ 基因多态性与凝血纤溶功能进行研究, 探讨FⅫ 多态性对患者凝血纤溶功能的影响。

材料和方法
一、研究对象

选择2008年6月至2009年6月期间在温州医学院附属第一医院住院的静脉血栓形成患者75例(其中下肢深静脉血栓55例、肺栓塞16例、肠系膜静脉血栓4例), 男32例, 女43例, 年龄20~85岁, 均经彩色B超、CT或血管造影结合临床表现由专业医生确诊, 采血均为溶栓治疗前, 所有患者均被排除肝脏病变。正常对照组60名, 男女各半, 年龄21~68岁, 均为健康体检者, 无心脑血管及肝脏疾病, 无高血压、糖尿病及血栓性疾病史。所有研究对象均知情同意。

二、研究方法

1.标本采集及DNA抽提

空腹抽取静脉血栓形成患者在溶栓治疗前及正常对照者足量静脉血于0.109 mol/L枸橼酸钠的真空采血管中, 颠倒混匀后 1 450 g离心10 min, 得乏血小板血浆(PPP), 置-80 ℃冰箱保存待检。并同时抽取1 mL 乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血, 用树脂型基因组DNA提取试剂盒抽提全血标本中的单个核细胞的基因组DNA, 置-80 ℃冰箱保存。树脂型基因组DNA提取试剂盒购自上海赛百盛生物工程有限公司。

2.血浆凝血纤溶指标的检测

采用一期凝固法检测血浆凝血因子Ⅻ 活性(FⅫ ∶ C)、凝血因子Ⅷ 活性(FⅧ ∶ C); 采用Clauss法测定纤维蛋白原(FIB); 采用免疫比浊法测定D-二聚体(D-D)、血管性血友病因子(VWF); 采用发色底物法测定纤溶酶原活性(PLG ∶ A)、抗凝血酶活性(AT ∶ A)、蛋白C活性(PC ∶ A)等各项指标。上述项目的检测均在法国STAGO-STA自动血凝仪上进行(配套试剂由法国STAGO公司提供), 所有操作步骤均严格按照试剂说明书进行。

3.FⅫ 基因第46位多态性直接测序

用上述DNA提取试剂盒抽提基因组DNA, 根据FⅫ 基因序列(GenBank AF538691), 应用primer5软件设计覆盖FⅫ 基因启动区第46位碱基的1+2外显子区域及其侧翼序列的引物。引物由上海生工生物工程有限公司合成。上游:5'-CCAGTCCC-ACTATCTAGAAAAG-3', 下游:5'-CTATCACA-GCCATGAGCCAT- 3'。聚合酶链反应(PCR)试剂盒购自上海生工生物工程有限公司, PCR扩增如下:95 ℃预变性5 min, 然后95 ℃变性30 s, 64 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 共30个循环, 72 ℃延伸10 min。PCR产物大小为594 bp, 取PCR产物5 μ L在1.2%琼脂糖凝胶上电泳, 用Goldview标记PCR产物。PCR产物原液送上海生工生物工程有限公司测序, 所用测序仪为ABI PRISM 3730, 测序试剂为BigDye terminator。用Chromas软件将测序结果与美国NCBI基因库所公布的FⅫ 基因序列(GenBank AF538691)进行比对(Blaster), 寻找基因突变及确定启动区第46位碱基多态性。

三、统计学方法

采用SPSS 13.0

统计学软件进行数据分析, 血浆各指标结果以 x-± s表示, 各组间比较采用方差分析及两两比较。各组间基因多态性频数分布分析及比较采用χ 2检验。

结果
一、各组FⅫ 基因多态性分布及比较

FⅫ 基因启动区第46位多态性有3种型别:46TT(46位T/T型)、46CT(46位C/T型)、46CC(46位C/C型)。静脉血栓形成组与正常对照组FⅫ 基因第46位多态性频数分布比较, 2组间差异有统计学意义(P< 0.05), 即静脉血栓形成组的46TT多态性高于正常对照组。见表1。

表1 静脉血栓形成患者及正常对照组FⅫ 基因46C/T多态性频数分布及分析
二、静脉血栓形成组FⅫ 多态性对凝血纤溶功能的影响及比较

静脉血栓形成组46TT型FⅫ 活性明显低于46CT、46CC型及正常对照组(P均< 0.05), 其他组间FⅫ 活性与正常对照组比较差异无统计学意义(P> 0.05)。静脉血栓形成组FⅫ 基因46TT型的AT活性低于正常对照组(P< 0.05), FIB、D-D、FⅧ ∶ C和VWF含量明显高于正常对照组(P均< 0.05)。静脉血栓形成组46CT型中FIB、D-D、FⅧ ∶ C和VWF含量也高于正常对照组(P均< 0.05); 46CC型患者FIB、D-D也增高(P均< 0.05)。静脉血栓形成FⅫ 基因各型PLG ∶ A及PC活性与正常对照组比较差异均无统计学意义(P均> 0.05); 并且静脉血栓形成组的FⅫ 基因各型之间的FIB、D-D、FⅧ ∶ C、VWF及AT ∶ A差异亦无统计学意义(P均> 0.05)。见表2。

表2 静脉血栓形成患者FⅫ 基因多态性对凝血纤溶功能的影响及比较( x-± s)
讨论

FⅫ 也称Hageman因子, 是内源性凝血途径的启动因子, 血浆中FⅫ 是以酶原形式存在, 当血液与带负电荷的异物表面接触时, FⅫ 活化为具有酶解活性的FⅫ a。FⅫ 基因定位于5号染色体长臂5q33-qter, 由14个外显子和13个内含子组成。FⅫ cDNA长度为2 044 bp, 包括49 bp的 5'端非翻译区, 1 845 bp的氨基酸编码区以及150bp的3'端非编码区, 转录位点在翻译起始密码子ATG上游49bp处。本研究对FⅫ 因子启动区的第46位碱基多态性直接测序, 结果表明FⅫ 基因第46位多态性中, 基因T/T型在静脉血栓形成组中比例更高, 同时显示FⅫ 基因46TT组的FⅫ 活性明显低于46CT、46CC型及正常对照组, 因而FⅫ 活性更低, 可能会导致静脉血栓的危险性增加, 与欧美报道相符[5, 6]。并且本研究发现FⅫ 基因第46位多态性分布与欧美白人不同, 提示本研究人群的46 C> T突变的发生率与欧美人群分布不同, 进一步表明FⅫ 基因46位多态性分布存在种族地域差异[7]。

本研究将静脉血栓形成患者组按FⅫ 46位基因多态性分3组, 发现静脉血栓形成患者FⅫ 基因46TT型的AT活性低于正常对照组, 而FIB、D-D、FⅧ ∶ C和VWF含量明显高于正常对照组, 但PLG ∶ A和PC活性差异均无统计学意义; 在46CT型中FIB、D-D、FⅧ ∶ C和VWF含量也高于正常对照组, 而46CC型患者中仅FIB、D-D增高; 静脉血栓形成组FⅫ 各基因型之间的上述指标差异均无统计学意义。上述结果表明在静脉血栓形成中患者均存在不同程度的高凝状态, 高凝严重程度与多态性分布无关; 但TT型患者AT活性下降较正常对照组明显, 存在更弱的抗凝活性并易于形成静脉血栓。有研究表明[8], FⅫ 在纤溶系统中的作用远大于在内源性凝血途径中的作用, 在纤溶系统中FⅫ 与组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)和尿激酶型纤溶酶原激活剂(u-PA)具有同源性的丝氨酸结构, 都可以直接或间接地激活纤溶酶原, 生成纤溶酶, 从而激活纤溶系统; 另有研究也证实FⅫ 46C/T多态性与FⅫ 活性和抗原含量有关, 并且具有T等位基因者抗原含量和活性下降[9], 因而FⅫ 减低易导致纤溶活性下降, 使纤溶酶原未被过多消耗, 故总体上纤溶酶原活性无明显变化; 并也从侧面反映了高凝状态下纤溶活性下降, 因而TT型患者更易形成血栓。本研究发现, 静脉血栓形成的FⅫ 基因多态性各型之间凝血纤溶指标的差异无统计学意义, 可能是病例数不足原因, 也可能在静脉血栓形成后机体凝血和纤溶系统被激活, 表现出凝血和纤溶功能具有各型之间相似性。

综上所述, 在FⅫ 基因第46位多态性分布上, 静脉血栓形成患者FⅫ 基因46TT多态性明显增多而导致FⅫ 活性明显下降; 同时也发现FⅫ 基因多态性各组之间凝血和纤溶功能差异无统计学意义。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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