引用本文
肖春海, 黄敏洁, 吴娟芳, 赵忆凡, 沈玉萍. 磺基水杨酸检测尿液和脑脊液蛋白自动比浊法的建立. 2012, 27(3): 178-180
XIAO Chunhai, HUANG Minjie, WU Juanfang, ZHAO Yifan, SHEN Yuping. Establishment of a method for detecting urine and cerebro-spinal fluid proteins by sulfosalicylic acid turbidimetry using automatic biochemical analyzer. Labratory Medicine, 2012, 27(3): 178-180  
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磺基水杨酸检测尿液和脑脊液蛋白自动比浊法的建立
肖春海, 黄敏洁, 吴娟芳, 赵忆凡, 沈玉萍
上海市第六人民医院金山分院检验科,上海 201500

作者简介：肖春海,男,1976年生,学士,主管技师,主要从事临床免疫和临床生化检验工作。

摘要

目的 对磺基水杨酸比浊法进行改良,并对其测定尿液和脑脊液蛋白的自动化分析进行评价。方法 应用改良磺基水杨酸仪器比浊法(简称仪器法),在全自动生化分析仪上建立测定参数,评价其方法的精密度、线性范围、回收率,并与手工磺基水杨酸比浊法(简称手工法)进行比较。结果 批内和批间变异系数( CV )分别为1.2%~1.5%和2.1%~3.5%。线性范围为0.037~2.38 g/L。回收率为85.6%~109.2%。与手工法比较, Y仪器 = 0.980 4 X手工+0.010 8,相关系数( r) = 0.982。结论 改良的磺基水杨酸比浊法测定微量总蛋白具有较高的精密度和准确度,适合于全自动生化分析仪。

关键词: 尿蛋白; 磺基水杨酸; 比浊法; 全自动生化分析仪
中图分类号:R446.12 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)03-0178-03
Establishment of a method for detecting urine and cerebro-spinal fluid proteins by sulfosalicylic acid turbidimetry using automatic biochemical analyzer
XIAO Chunhai, HUANG Minjie, WU Juanfang, ZHAO Yifan, SHEN Yuping
Department of Clinical Laboratory, Jinshan Branch of Shanghai Sixth People's Hospital,Shanghai 201500,China
Abstract

Objective To evaluate and improve the method for detecting urine and cerebro-spinal fluid proteins by sulfosalicylic acid turbidimetry using automatic biochemical analyzer.Methods The improved sulfosalicylic acid turbidimetry using automatic biochemical analyzer(I-SS assay) and its parameters were established. The precision,linear range and recovery rate were evaluated and compared with the traditional sulfosalicylic acid turbidimetry(T-SS assay).Results The within-run and between-rum coefficients of variation( CV) were 1.2%-1.5% and 2.1%-3.5%. The linear range was 0.037-2.38 g/L. The recovery rate was 85.6%-109.2%. The correlation with the T-SS assay was YI-SS = 0.980 4 XT-SS +0.010 8, and the correlation coefficient ( r) was 0.982.Conclusions The I-SS assay is sensitive and accurate, and it is suitable to automatic biochemical analyzer.

Keyword: Urine protein; Sulfosalicylic acid; Turbidimetry; Automatic biochemical analyzer
引言

尿液和脑脊液蛋白的测定是目前临床基本且常规检验项目, 其测定方法有《全国临床检验操作规程》(第3版)介绍的邻苯三酚红钼络合显色法、磺基水杨酸比浊法和伊红Y染料结合法, 以及罗氏的苄索氯胺比浊法等方法。但目前仍有很多基层医院由于样本量不大, 没有采用商品化试剂盒在生化仪上测定尿液和脑脊液蛋白, 仍采用磺基水杨酸手工比浊法(简称手工法)。我们采用自改良的磺基水杨酸试剂在全自动生化分析仪上建立磺基水杨酸仪器比浊法(简称仪器法), 进行尿液和脑脊液总蛋白测定, 并对测定方法的基本性能进行评估。

材料和方法
一、 仪器

雅培C8000全自动生化分析仪, 上海721分光光度计, 上海安亭TDL-80-2B型低速台式离心机。

二、 试剂

1. 手工法试剂

按照卫生部医政司《全国临床检验操作规程》(第3版)配置[1]:磺基水杨酸3.0 g, 无水硫酸钠7.0 g, 以去离子水溶解并稀释至100 mL。

2. 仪器法试剂

磺基水杨酸3.0 g, 无水硫酸钠6 g, 氯化钠1.2 g, 以去离子水溶解并稀释至100 mL。

3. 蛋白系列标准液

罗氏公司蛋白标准液, 代号为03121305-122, 批号为159647, 总蛋白含量为2.380 g/L。

三、 测定方法
1. 手工法

取样本0.5 mL加磺基水杨酸试剂4 mL, 混匀后室温放置10 min, 在721分光光度计上530 nm比浊。以试剂空白校正零点, 读取各管吸光度(A)值。使用罗氏蛋白标准品用生理盐水对倍稀释, 共5点(0.149、0.298、0.595、1.190、2.380 g/L)定标绘制标准曲线, 从曲线上查得蛋白含量。

2. 仪器法

在雅培C8000全自动生化分析仪上应用仪器法试剂。用去离子水把蛋白含量为2.380 g/L的罗氏蛋白定标液对倍稀释成1.190、0.595、0.298、0.149 g/L, 以此进行多点校正。测定参数:分析方法1 point [END UP]; 主/副波长 548/660 nm; 样本量 25 μ L; 试剂量200 μ L; 主要读点3133; 校正方法spline; 标准浓度5点(0.149、0.298、0.595、1.190、2.380 g/L)。

四、统计学方法

采用SPSS13.0统计软件进行t检验和相关性分析。

结果
一、定标结果

手工法和仪器法的定标液浓度及其相应的A值见表1。

表1 手工法和仪器法的定标浓度及A值
二、反应曲线

根据仪器设置对浓度为0.963 g/L的样本在雅培C8000全自动生化分析仪上进行测定, 其反应曲线见图 1。

图1 仪器法测定结果为0.963 g/L样本的反应曲线

三、精密度试验

随机取1份尿液总蛋白阳性样本, 1 300× g离心5 min。取上清液连续检测20次, 求得批内均值( x-)为1.270 g/L, 批内变异系数(CV)为1.5%。将此样本分装10份, -30 ℃冰冻保存, 每2天取出1份样本, 每天1次, 在雅培C8000全自动生化分析仪上连续检测20 d, 求得批间 x-为1.249 g/L, 批间CV为2.1%。

随机收集3份脑脊液样本混合, 1 300× g离心5 min。取上清液连续检测20次, 求得批内 x-为0.591 g/L, 批内CV为1.2%。将此样本分装10份, -30 ℃冰冻保存, 每2天取出1份, 每天1次, 在雅培C8000全自动生化分析仪上连续检测20 d, 求得批间 x-为0.588 g/L, 批内CV为3.5%。

按以上仪器法精密度试验方法, 在721分光光度计上进行手工法的精密度试验。结果见表 2。

表2 手工精密度结果
四、灵敏度试验

取2.380 g/L蛋白质标准液, 用生理盐水对倍稀释至0.149、0.075、0.037和0.019 g/L, 用手工法和仪器法分别连续测定20次, 分别计算批内CV。以重复测定CV=20%为功能灵敏度[2], 手工法和仪器比浊法的灵敏度(即可报告定量低限)分别为0.075和0.019 g/L。

五、线性范围

把2.380 g/L蛋白标准液依次对倍稀释至1.190、0.595、0.298、0.149、0.075、0.037 g/L, 分别重复测定3次取平均值, 测定值(r)与目标靶值(x)的线性回归方程为Y =1.006 6X +0.003 3, r=0.999, P< 0.01。仪器法的线性范围为0.037 2.380 g/L。

六、回收试验

在150 μ L患者尿液样本中分别加入蛋白浓度为2.380和0.595 g/L的标准液50 μ L, 患者尿液样本加入标准液前、后分别检测其蛋白浓度。回收率[2]=(加入标准后样本蛋白质量-加入标准前样本蛋白质量)/理论回收蛋白质量 × 100%。结果见表3。

表3 磺基水杨酸仪器比浊法回收试验结果
七、相关性比较

分别采用仪器法和手工法测量44份样本, 样本浓度范围为0.12.0 g/L。回归方程为Y仪器 = 0.980 4X手工+0.010 8, r=0.982, P> 0.05。2种方法的结果差异无统计学意义。

讨论

无水硫酸钠在0 ℃时在100 mL水中的溶解度为4.5 g[3], 在10 ℃时的溶解度为9.2 g, 所以如果采用手工法的7%硫酸钠溶液直接放在全自动生化仪试剂冷藏仓中则有可能会有芒硝(Na2SO4· 10H2O)结晶析出。经验证把手工法试剂放入冰箱中确实会有结晶析出。在酸性条件下, 磺基水杨酸的磺酸根阴离子与蛋白质氨基酸阳离子结合, 形成不溶性蛋白盐沉淀。所以能否有效地破坏白蛋白和球蛋白表面的水化层在形成蛋白盐反应中至关重要, 而中性盐是很好的物质。硫酸铵的溶解度受温度影响小, 但会干扰蛋白测定。经计算, 6 g无水硫酸钠和1.2 g氯化钠互溶后溶液的离子强度正好和手工法试剂一致。所以在仪器法试剂中加入了少量氯化钠, 保持离子强度不变且能有效地破坏蛋白分子表面的水化层。经试验, 仪器法试剂放在雅培C8000全自动生化分析仪试剂仓中过夜没有结晶析出。

由于磺基水杨酸法测定蛋白线性一点定标的线性范围窄, 特别是在高浓度蛋白样本中不呈线性关系[4]。所以手工法采用5点绘制标准曲线, 仪器法则采用了非线性多点定标保障结果的准确性。仪器法的线性范围为0.0372.380 g/L, 样本如超过此范围要稀释后再检测, 可以采用手工稀释或仪器自动稀释。

仪器法采用双波长透射比浊, 能很好的消除样本本身的浊度和溶血等自身背景的影响, 弥补了手工法单波长的不足。精密度试验结果说明仪器法在尿液样本和脑脊液样本的微量总蛋白定量中有很好的重复性, 灵敏度试验说明仪器法的灵敏度更高, 回收试验和相关性比较也说明了仪器法有很好的准确度和可靠性, 能满足临床需求。

现在很多实验室都实现实验室信息系统(LIS)和样本条码化。磺基水杨酸仪器比浊法能在全自动生化分析仪上完成自动化, 适应了实验室的发展需要。由于样本用量小(仅25 μ L), 实现了一个样本同时在全自动生化分析仪上可以检测其他项目的需求, 如脑脊液样本要同时检测葡萄糖、钠离子和氯离子, 而尿液样本则要同时检测肌酐、微量白蛋白甚至是尿糖、α 1-微球蛋白或β 2-微球蛋白。由于磺基水杨酸试剂成本十分廉价, 所以可以根据实际情况定期更换试剂和定标。仪器法在日常工作中需要严格执行室内质控制度, 发现失控及时采取纠正措施。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] 叶应妩, 王毓三, 申子瑜. 全国临床检验操作规程[M]. 第3版. 南京: 东南大学出版社, 2006: 342-344. [本文引用:1]
[2] 丛玉隆, 尹一兵, 陈瑜. 检验医学高级教程[M]. 北京: 人民军医出版社, 2010: 523-528. [本文引用:2]
[3] 北京石油化工工程公司. 氯碱工业理化常数手册(修订版)[M]. 北京: 化学工业出版社, 1988: 27-30. [本文引用:1]
[4] 张建荣, 李闻捷, 徐德安. 尿液和脑脊液蛋白测定自动比浊法的评价[J]. 上海医学检验杂志, 2002, 17(1): 21-23. [本文引用:1]