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盛跃颖, 陈洪友, 张曦, 庄源, 陈敏. 免疫磁珠捕获法检测志贺菌的模拟研究. 2012, 27(3): 167-170
SHENG Yueying, CHEN Hongyou, ZHANG Xi, ZHUANG Yuan, CHEN Min. The simulation study of immunomagnetic separation method for the detection of Shigella species . Labratory Medicine, 2012, 27(3): 167-170  
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免疫磁珠捕获法检测志贺菌的模拟研究
盛跃颖, 陈洪友, 张曦, 庄源, 陈敏
上海市疾病预防控制中心,上海 200336

作者简介：盛跃颖,女,1978年生,学士,主管技师,主要从事病原菌检验工作。

通讯作者：陈敏,联系电话：021-62758710。

基金:上海市卫生局课题资助项目（2009186）
摘要

目的 评估所制备的志贺菌免疫磁珠特异性富集作用,为建立基于免疫磁珠捕获法的志贺菌检测流程提供技术依据。方法 制备志贺菌属细菌(鲍氏志贺菌除外)、非目标菌(大肠埃希菌、产气肠杆菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、弗尼斯弧菌、表皮葡萄球菌)的菌悬液,利用志贺菌特异性多抗免疫磁珠进行捕获,接种平板后进行菌落计数,并计算免疫磁珠的特异性及非特异性吸附效率。设计干扰试验,在含有104 cfu/mL的大肠埃希菌悬液中,加入不同浓度的目标菌,用所制备的磁珠进行捕获,评估免疫磁珠的特异性富集效率。在经3和6 h预增菌的含有已知量目标菌的奶粉模拟标本及未增菌的粪便模拟标本中,分别加入所制备的磁珠进行捕获,评估基于免疫磁珠捕获法的志贺菌检测流程的可行性。结果 菌落计数表明,制备的志贺菌免疫磁珠对痢疾志贺菌、福氏志贺菌和宋内志贺菌的捕获效率均超过30%,对6种非目标菌的非特异性吸附效率<3%。干扰试验结果显示,与常规直接平板接种法相比,免疫磁珠捕获法的敏感性提高了约100倍;奶粉和粪便模拟试验的结果显示,免疫磁珠捕获法的最低检测限分别可达101 cfu/25 g和101 cfu/mL,并对标本中目标菌的检出率有一定提高。结论 志贺菌免疫磁珠对志贺菌属细菌(鲍氏志贺菌除外)具有一定特异捕获与富集作用,可应用于实验室的日常检测工作。

关键词: 免疫磁珠; 志贺菌; 吸附效率
中图分类号:R378.2 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)03-0167-04
The simulation study of immunomagnetic separation method for the detection of Shigella species
SHENG Yueying, CHEN Hongyou, ZHANG Xi, ZHUANG Yuan, CHEN Min
Shanghai Municipal Center For Disease Control and Prevention, Shanghai 200336,China
Abstract

Objective To evaluate specific enrichment reactions of immunomagnetic beads of Shigella, and to provide the technical basis for establishing immunomagnetic separation method for the detection of Shigella species.Methods Pure cultures of Shigella species(except Shigella boydii) and non-target bacteria ( Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Vibrio fluvialis and Staphylococcus epidermidis) were used to calculate specific and non-specific capture efficiencies of the immunomagnetic beads by counting the colony. Interference experiments were designed to evaluated the specific enrichment reaction of the immunomagnetic beads, which was performed by adding the immunomagnetic beads into the suspensions of the mixtures with 104 cfu/mL Escherichia coli and different concentrations of target bacteria. The beads were used to capture the Shigella from the milk powder samples which were pre-enriched for 3 and 6 h and fecal samples. The possibility of using immunomagnetic separation method to detect Shigella was evaluated.Results The capture efficiency of immunomagnetic beads was above 30% to the pure cultures of Shigella dysenteriae, Shigella flexneri and Shigella sonnei, and the non-specific capture efficiency of 6 non-target bacteria was below 3%. The data of the interference experiments showed that immunomagnetic separation method had 100 fold increasing in the detection sensitivity in comparison with conventional testing methods. The results of the tests of artificially inoculated milk powder and fecal samples showed that the detection limits could reach 101 cfu/25g and 101 cfu/mL by immunomagnetic separation method, and the detection rate of the target bacteria increased.Conclusions Immunomagnetic beads have some specific capture and enrichment reactions to Shigella dysenteriae, Shigella flexneri and Shigella sonnei, and it should be applied into routine diagnostic determinations.

Keyword: Immunomagnetic bead; Shigella; Capture efficiency
引言

志贺菌感染可引起一种常见的肠道传染病— — 细菌性痢疾。在我国, 由志贺菌引起的食物中毒事件时有报道[1, 2]。该菌属细菌的感染剂量低, 少量细菌感染即可导致发病。但由于受污染的食品中或带菌者中该病原菌含量可能很低, 而其他杂菌种类复杂, 易造成漏检。为提高实验室对该菌的检出率, 本研究拟在检测流程中引入志贺菌多抗免疫磁珠, 通过对模拟标本(食品及粪便标本)中的目标菌进行捕获后分离培养, 并与传统分离方法进行比较, 初步评估免疫磁珠捕获法对目标菌检出率的影响。

材料和方法
一、 材料

1. 试验菌株

用于免疫动物制备抗血清的菌株分别由南开大学泰达生物技术学院和本实验室菌种库提供, 血清型分别为痢疾志贺菌2型、福氏志贺菌(1a、1b、2a、2b、3a、3b、4a、4b、5a、5b、6、x、y)及宋内志贺菌Ⅰ 型。其他试验菌株购自美国典型菌种保藏中心(ATCC)、中国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)或由本实验室菌种库提供。

2. 志贺菌多抗免疫磁珠的制备

志贺菌属多抗免疫磁珠的制备由天津生物芯片技术有限公司协助完成。采用Dynal公司的表面羧基化磁珠, 粒径为1 μ m。免疫大耳白兔获得针对志贺菌的多克隆抗血清, 与裸磁珠偶联后再进行封闭。

3. 试剂和仪器

志贺菌诊断血清购自兰州生物制品研究所。水解酪蛋白胨(MH)平板、麦康凯平板、革兰阴性杆菌(GN)增菌液、含有0.1% 吐温20的磷酸盐缓冲液(PBS-T, pH值 7.2~7.4)为上海市疾病预防控制中心培养基室配制。木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂平板购自上海科玛嘉公司。麦氏比浊仪购自法国生物梅里埃公司。磁力架和混旋仪均购自Invitrogen公司。

4. 菌悬液的制备

取各试验菌株复苏后, 用比浊仪调节麦氏浊度为1.0~1.5作为原液(起始菌浓度约108 cfu/mL), 用1%灭菌脱脂牛奶液体进行系列(10倍)稀释至菌浓度约为101 cfu/mL。取推算浓度为103 cfu/mL的菌液100 μ L接种MH平板, 置37 ℃培养过夜后观察, 进行平板计数, 准确细菌定量。

二、方法

1. 吸附效率及特异性测定

选取本实验室保存的痢疾志贺菌2型1株、福氏志贺菌(1a、1b、2a、2b、3a、3b、4a、4b、5a、5b、6、x、y)各1株、宋内志贺菌Ⅰ 型1株及非目标菌(大肠埃希菌、产气肠杆菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、弗尼斯弧菌、表皮葡萄球菌)各1株按菌悬液制备的方法配制一系列菌悬液, 选择102 cfu/mL浓度的菌悬液1 mL, 取50 μ L接种MH平板, 进行准确的细菌定量推算菌悬液浓度。在剩余各菌悬液中分别加入50 μ L 志贺菌多抗免疫磁珠, 在常温混合15 min后, 用混旋仪以100 g的匀速混合15 min, 然后置于磁力架上作用3 min, 弃去上清, 加入1 mL PBS-T缓冲液重悬磁珠进行洗涤后, 重新做磁场分离, 重复该洗涤步骤2次后, 用50 μ L缓冲液重悬磁珠, 涂布MH平板, 置37 ℃培养过夜后观察结果, 进行菌落计数并计算吸附效率:吸附效率(%)=吸附后平板上目标菌数量/吸附前标本中目标菌数量× 100%。

2. 干扰试验

配制浓度约104 cfu/mL的干扰菌[大肠埃希菌(ATCC 25922)]形成原始菌液, 分装成1 mL/管, 再在原始菌液中定量依次加入3株实验室分离株(分别为痢疾志贺菌2型, 福氏志贺菌1a, 宋内志贺菌Ⅰ 型), 使其终浓度分别约为104、103、102和101 cfu/mL, 充分混合后取1环(约10 μ L)直接划麦康凯平板进行培养作比对, 再在各菌液标本中加入50μ L 志贺菌多抗免疫磁珠, 进行免疫磁珠捕获后, 涂布麦康凯平板, 置37 ℃培养过夜观察结果, 并进行菌落计数。

3. 志贺菌多抗免疫磁珠对食品模拟标本的检测

取25 g 奶粉加入225 mL的GN增菌液, 再分别加入104、103、102、101 cfu/mL的3株实验室分离株(分别为痢疾志贺菌2型、福氏志贺菌1a、宋内志贺菌Ⅰ 型)各1 mL, 制成模拟标本12份, 置于37 ℃增菌3和6 h后, 取1环(约10 μ L)直接划XLD平板进行培养、比对。同时取1 mL增菌液加入50 μ L志贺菌多抗免疫磁珠, 进行免疫磁珠捕获后, 涂布XLD平板, 置37 ℃培养过夜观察结果, 并进行菌落计数。

4. 志贺菌多抗免疫磁珠对粪便模拟标本的测定

以常规培养法志贺菌检测结果为阴性的粪便10份, 分别加入适量生理盐水混匀成稀糊状, 分装成1 mL/管。再定量依次加入3株实验室分离株(分别为痢疾志贺菌2型、福氏志贺菌1a、宋内志贺菌Ⅰ 型), 使其终浓度分别为104、103、102和101 cfu/mL。充分混合后取1环(约10 μ L)直接划XLD平板进行培养、比对, 再在各标本中加入50 μ L 志贺菌多抗免疫磁珠, 进行免疫磁珠捕获后, 涂布XLD平板, 置37 ℃培养过夜观察结果, 并进行菌落计数。

三、统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行分析, 组间比较采用 χ 2检验, P< 0.05为差异有统计学意义。

结果
一、吸附效率测定

为了解所制备志贺菌多抗免疫磁珠对目标菌和非目标菌的捕获率, 用本实验室分离获得的志贺菌进行吸附效率的测定, 结果表明所制备的志贺菌多抗免疫磁珠对目标菌的吸附效率均> 30%, 对非目标菌的非特异性吸附率均< 3%。见表1。

表1 吸附效率测定结果
二、干扰试验

为了解在高浓度杂菌存在下, 免疫磁珠对目标菌的捕获率是否受到影响, 将104 cfu/mL干扰菌[大肠埃希菌(ATCC 25922)]菌悬液分别与不同浓度梯度的3种目标菌(痢疾志贺菌2型、福氏志贺菌1a、宋内志贺菌Ⅰ 型)混合后进行免疫磁珠捕获, 结果显示在干扰菌浓度高于目标菌浓度1 000倍的情况下(志贺菌/大肠埃希菌的混合比例为1× 101/1× 104), 目标菌检出结果仍为阳性, 其方法敏感性比直接平板划线分离提高了约100倍。见图1。

图1 干扰试验结果

三、志贺菌多抗免疫磁珠对食品模拟标本的检测

在奶粉模拟标本中, 分别加入一系列浓度的3种目标菌, 在3 h时利用免疫磁珠富集后, 其检测限最低可为101 cfu/25 g, 在6 h时, 2种方法的检测限均达到101 cfu/25 g。见表2。

表2 免疫磁珠捕获法及直接平板分离法检测效果的比较[%(阳性标本数/总标本数)]
四、志贺菌多抗免疫磁珠对粪便模拟标本的检测

在10份正常粪便标本中, 分别加入不同量的3种目标菌, 利用免疫磁珠捕获后其检测限最低可为101 cfu/mL。在加入目标菌量103和104 cfu的情况下, 免疫磁珠处理后的检出率明显高于直接平板划线法(P< 0.05), 在加入目标菌量为101、102和105 cfu时, 2种方法的检出率差异无统计学意义(P> 0.05)。见表3。

表3 免疫磁珠捕获法及直接平板分离法检测效果的比较[%(阳性标本数/总标本数)]
讨论

免疫磁珠分离技术是一种利用经过修饰的磁性微球作为载体进行目标物捕获及富集的技术[3]。在病原微生物检测领域, 可用特异性抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)包被磁珠, 通过抗原抗体反应, 若标本中存在靶微生物, 即可形成磁珠-目标微生物复合物, 并在外部磁力作用下, 将目标微生物从标本中分离出来。目前针对大肠埃希菌(血清型O26、O111、O157等)、沙门菌等的免疫磁珠已被商业化, 副溶血弧菌、念珠菌等其他病原体的免疫磁珠也被相继开发, 并应用到各种科研及实验室检测工作中[4, 5]。

本研究中采用的志贺菌免疫磁珠包被的针对志贺菌属(除鲍氏志贺菌)的特异性多克隆抗体, 其制备简易, 选择上海地区的分离株对其进行吸附效率测定的结果显示, 其对目标菌有较好的富集作用。为进一步评估免疫磁珠分离技术进行标本的前处理后是否能提高培养法的敏感性, 缩短检测时间, 我们进行了食品和粪便的模拟标本检测。以低污染的奶粉为食品的模拟标本, 加入10~10 000个目标菌进行2个增菌时间点的取样检测。免疫磁珠捕获法由于取样量大(一般1 mL)且有较好的富集作用, 因此在增菌3 h时其检测限已达到101 cfu/25 g, 比传统的直接平板分离法提高至少10倍。按照食品卫生微生物学检验标准(GB/T 4789.5-2003)进行6 h增菌后, 直接平板分离法达到和免疫磁珠富集法相同的检测限。可见, 在标本前处理中加入免疫磁珠可缩短检验流程中所需增菌的时间, 提高方法的敏感性。

在粪便模拟标本的试验中, 正常人粪便中大肠埃希菌等杂菌成分复杂, 进行增菌时, 大量杂菌的生长速度远超过了目标菌, 易导致结果的假阴性, 因此在这类模拟标本检测过程中, 未设计增菌步骤。在试验中发现, 由于标本中背景菌浓度较高, 且可存在各类食物残渣等, 对磁珠吸附效率、方法的检测限都有所影响。在干扰试验中, 即使存在较高浓度的干扰菌, 但由于干扰菌成分单一(只有一种菌), 且无其他杂质干扰, 免疫磁珠法的检测限可达101 cfu/mL。但在粪便模拟标本中, 该方法仅对1份粪便标本(3种目标菌)的检出限为101 cfu/mL(该标本中杂菌浓度较低)。可见, 在不同的标本性状及杂菌污染程度下, 免疫磁珠和目标微生物相互作用会受到影响, 可降低该技术的敏感性和特异性。有研究表明, 杂菌污染较多且富含脂质的牛肉类制品, 并不适用于该技术的检测[6]。

我们也对腹泻患者的粪便标本进行了检测, 免疫磁珠捕获法和直接平板分离法的检测结果一致, 未体现出前者对检出率的提高(具体检测数据未统计)。这主要是由于这类粪便标本中致病菌往往为优势菌种, 菌量较大, 对这类标本的检测不能充分体现免疫磁珠法的优势。因此应扩大检测范围, 对标本中目标菌量较低的标本进行检测, 如慢性携带者或已使用过抗菌药物患者的标本, 利用免疫磁珠进行前处理, 进一步评估免疫磁珠法对粪便中目标菌检出率的影响。

综上所述, 所制备的志贺菌免疫磁珠经本研究初步评估可应用于相关实验室对食品或粪便标本检测, 在对各类标本的检测中, 可进一步收集数据, 验证并完善方法, 以增加其实用性。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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