引用本文
朱燕, 徐克前, 王晓春. 孕妇血浆中游离胎儿DNA在产前诊断中的初步应用. 2012, 27(3): 159-162
ZHU Yan, XU Keqian, WANG Xiaochun. Primary application of free fetal DNA from maternal plasma in prenatal diagnosis. Labratory Medicine, 2012, 27(3): 159-162  
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孕妇血浆中游离胎儿DNA在产前诊断中的初步应用
朱燕, 徐克前, 王晓春
中南大学湘雅医学院检验系,湖南 长沙 410013

作者简介：朱燕,女,1976年生,硕士,讲师,主要从事分子生物学和临床生化教学工作。

摘要

目的 探讨孕妇血浆中游离胎儿DNA在非创伤性产前诊断中的可行性。方法 用柱分离法提取46例孕妇血浆中胎儿DNA,用巢式聚合酶链反应(PCR)技术扩增其胎儿 SRY基因,并引入内参照基因 ATL1特异序列。结果 28例孕男胎的孕妇血浆中有26例经巢式PCR扩增出 SRY基因,18例孕女胎的孕妇血浆中有17例经巢式PCR只扩增出 ATL1基因。灵敏度和特异度分别为92.9%(26/28)和94.4%(17/18),总符合率为93.5%(43/46)。结论 应用孕妇血浆中胎儿DNA作产前诊断灵敏度和特异度较高,是一种非创伤性产前诊断方法,具有广泛的临床应用前景。

关键词: 胎儿DNA; 巢式聚合酶链反应; 产前诊断
中图分类号:R446.11 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)03-0159-04
Primary application of free fetal DNA from maternal plasma in prenatal diagnosis
ZHU Yan, XU Keqian, WANG Xiaochun
Faculty of Medical Laboratory, Xiangya School of Medicine, Central South University, Hunan Changsha 410013,China
Abstract

Objective To investigate the feasibility of free fetal DNA from maternal plasma in non-invasive prenatal diagnosis.Methods Free fetal DNA was extracted by column seperation from 46 maternal plasma, and nested polymerase chain reaction (PCR) was used to amplify the SRY gene, and ATL1 gene specific sequence was amplified as an internal control.Results The SRY gene sequence was detected in 26 maternal plasmas from 28 pregnant women with male fetus. In 17 maternal plasmas from 18 pregnant women with female fetus, only the ATL1 gene sequence was detected. The sensitivity was 92.9%(26/28),the specificity was 94.4%(17/18), and the coincidence rate was 93.5%(43/46).Conclusions Free fetal DNA from maternal plasma analysis is a non-invasive prenatal diagnosis and has the advantages of sensitivity and specificity, and it can improve in the clinical application.

Keyword: Fetal DNA; Nested polymerase chain reaction; Prenatal diagnosis
引言

传统的产前诊断的取材技术主要有羊水穿刺、绒毛膜活检和脐静脉穿刺术, 它们对母体和胎儿均有一定的危险性, 有发生感染、出血甚至流产的可能。微创伤性乃至非创伤性获取胎儿遗传物质进行产前基因诊断是临床一直追求的目标。胎儿有核细胞可存在于孕妇血循环中, 但胎儿细胞数量较少[1], 且存在个体差异, 分离富集方法繁琐[2], 所以很难应用于临床。1997年Lo等[3]首次证实孕妇血浆中存在着胎儿来源的游离DNA, 为利用孕妇血浆进行非侵入性产前诊断提供了一条崭新的途径。本研究应用巢式聚合酶链反应(nested-PCR) 技术检测孕妇外周血浆中游离胎儿 DNA 的性别决定基因(sex-determining region of the Y, SRY) , 探讨其用于非创伤性产前诊断的可行性。

材料和方法
一、研究对象

中南大学湘雅医学院附属医院及湖南省妇幼保健院产科住院的孕妇, 其中孕中期(13~27周)34例和孕晚期(28~40周)12例, 年龄21~35岁, 无妊娠并发症。另有1名未孕女性及1名健康男性分别作阴性和阳性对照, 性别记录以婴儿的出生性别为标准, 整个实验过程由1名女性工作人员操作。

二、方法
1. 主要试剂

dNTPs、TaqDNA聚合酶、缓冲液、聚合酶链反应(PCR)引物合成(上海生工生物有限公司); 相对分子质量标记物(北京天为时代科技有限公司); 血浆DNA提取试剂盒QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen, 德国)。

2. 血浆的制备和血浆DNA的提取

取孕妇外周静脉血3 mL, 乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝, 在3 h内490 g 离心10 min, 移取上层血浆于960 g 再次离心10 min, 吸取上层血浆400μ L采用柱分离法提取DNA, 按血样DNA 提取试剂盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit , Qiagen , 德国) 说明书中血液或体液DNA 提取方案“ Blood and Body Fluid Spin Protocol” 提取, 最后将DNA溶解于50μ L的DNA洗脱液AE中, 置-20 ℃冰箱保存。

3. 引物合成

采用巢式PCR方法扩增SRY基因(GenBank登录号:NC_000024), 基因位于Y染色体1 A1亚区, 定位在Yp11.3。外引物Y1:5'CTAGACCGCAGAGGCGCCCAT3', Y2: 5'TAGTA-CCCACGCCTGCTCCGG3', 扩增片段为239 bp。内引物Y3:5'CATCCAGAGCGTCCC-TGGCTT3', Y4:5'CTTTCCACAGCCACATTT-GTC3', 扩增片段为198 bp。用半巢式PCR扩增X染色体长臂的FMR1基因(GenBank登录号:NC_000023)上的一段序列ATL1[4]作为内参照, 外引物X1:5'CC-CTGATGAAGAACTTGTATCTC3', X3:5'GAAATT-ACACACATAGGTGGCACT3', 扩增片段为301 bp, 内引物X2:5'TCGCCTTTCTCAAATTCCAAG3', X3:5'GAAATTACACACATAGGTGGCACT3', 扩增片段为261 bp。

4. 优化PCR反应条件

为检验方法的敏感性, 将正常男性外周血基因组DNA 稀释成10个不同浓度梯度, 每μ L体积DNA含量分别为10、1、0.7、0.5、0.3、0.1 ng及70、50、30、10 pg, PCR 时每个梯度浓度的DNA设置3个平行管, 同样每份待测孕妇血浆标本、阳性对照(每管含男性DNA 100 pg) 、阴性对照(每管含未孕女性DNA 10 ng) 均设置3个平行管。参照Honda等[5]的判断标准为:3个平行管有2管以上阳性者为男性; 3个平行管均为阴性者为女性; 3个平行管中仅有1 管阳性结果, 再对该份样品重复检查1次, 若为阴性结果, 则为女性, 若有阳性结果, 则为男性。若阴性对照出现阳性条带, 表明PCR 受污染, 则该次实验结果从整个实验中剔除。最后将PCR 检测结果与最终性别标准进行比较分析。

5. 巢式PCR技术

PCR反应总体积为50 μ L, 第一轮PCR反应取10μ L血浆DNA提取物, 10× PCR Buffer 5μ L, dNTPs 200μ mol/L, MgCl2 1.5 mmol/L, Taq DNA聚合酶1.5 U, 引物Y1, Y2, X1, X3含量各20 pmol。反应在Thermo PCR仪上进行。反应条件为94 ℃预变性5 min , 94 ℃变性30 s, 56 ℃退火30 s , 72 ℃延伸45 s, 共40个循环, 72 ℃最后延伸10 min。取5μ L反应产物进行第二轮扩增, 第二轮PCR引物为X2, X3, Y3和Y4, 反应参数同前。用正常男性外周血基因组DNA优化PCR反应条件时PCR反应体系只加入扩增SRY基因的引物。反应结束后, 取10μ L产物经2%琼脂糖凝胶电泳, EB染色, 紫外灯下观察记录结果。

结果
一、建立巢式PCR方法的结果

第一轮PCR扩增后, 含量为10 ng和1 ng的模板DNA可见明显扩增产物(239 bp), 其他DNA含量的扩增条带模糊, 含量低于50 pg的模板DNA未能见到PCR产物(见图1)。第二轮巢式PCR扩增后, 均可见到明显的扩增产物(198 bp), 可稳定地扩增出低至10 pg的SRY基因片段(见图2), 说明此PCR体系可应用于血浆中微量胎儿DNA SRY基因的检测。

图1 第一轮PCR扩增结果图(注:模板DNA量依次为:1. 10 ng ; 2. 1 ng; 3. 0.7 ng; 4. 0.5 ng; 5. 0.3 ng; 6. 0.1 ng; 7. 70 pg; 8. 50 pg; 9. 30 pg; 10. 10 pg; M: 100 bp DNA ladder ; B: 阴性对照)

图2 第二轮PCR扩增结果图(注:模板DNA量依次为:1. 10 ng ; 2. 1 ng; 3. 0.7 ng; 4. 0.5 ng; 5. 0.3 ng; 6. 0.1 ng; 7. 70 pg; 8. 50 pg; 9. 30 pg; 10. 10 pg; M: 100 bp DNA梯度; B: 阴性对照)

二、SRY基因和ATL1基因检测结果

第二轮巢式PCR扩增后, 出现明显条带(见图3)。从孕男胎妇女血浆提取的DNA经PCR扩增后, 可检测到X染色体上的ATL1片段(261bp)和Y染色体上的SRY片段(198 bp), 而孕女胎妇女血浆中仅有ATL1片段(261 bp)。46例孕妇经随访确认28例怀有男胎, 18例怀有女胎。28例孕男胎的孕妇血浆标本有26例经巢式PCR扩增出SRY基因(198 bp), 2例假阴性, 灵敏度为92.9%(26/28)。18例孕女胎的孕妇血浆标本有17例只扩增出ATL1基因(261bp), 有1例检出SRY基因, 为假阳性, 特异性为94.4%(17/18), 总符合率为93.5%(43/46)。

图3 孕妇血浆游离胎儿DNA巢式PCR扩增结果图(注: 1. 阴性对照; 2. 孕女胎孕妇血浆; 3. 孕男胎孕妇血浆; 4.阳性对照; M:100 bp DNA梯度)

讨论

DNA的提取方法有多种, 如加热煮沸法、酚-氯仿法和磁珠法等。但血浆游离DNA具有微量及小片段的特征, 极易在提取过程中丢失而造成假阴性。本试验采用的QIAamp DNA提取试剂盒应用硅胶特异性吸附DNA原理, 选用层析微柱法提取血浆DNA, 可最大限度的获取和浓缩血浆DNA[6]。

由于目的核酸量低, 1次扩增的检出率较低, 应采用巢式PCR技术, 巢式PCR具有较高的敏感性和特异性。本研究中, 性别诊断灵敏度为92.9%, 特异性为94.4%, 总符合率为93.5%。与陈振斌等[7]的研究结果相符。出现2例假阴性, 估计原因为:(1)孕妇个体间的差异所致, 即胎儿DNA 在母血循环中出现和消失的时间在不同个体间存在差异; (2)胎儿DNA 浓度太低达不到常规扩增条件所要求的最低模板量。出现1 例假阳性, 分析原因可能包括:外源男性DNA 的污染, 因为孕妇血浆中胎儿DNA 含量甚微, 稍有不慎即可能造成污染; 在基因扩增过程中, 退火温度低时, 引物仍能与模板中的一些非靶位点错配, 从而形成非特异性扩增片段或引物二聚体; 前次妊娠残留胎儿DNA的干扰。

本试验采用X染色体上特异序列ATL1作为扩增内对照, 可防止假阳性的出现。亦有采用实时荧光PCR 检测Y 染色体上的特异序列的报道[8] , 此法具可靠性强、灵敏度高等优点, 但价格相对昂贵。

利用孕妇外周血作为检测材料, 克服了传统产前诊断技术在取材及检测时间等方面的缺陷。尽管从母血中得到的胎儿DNA很少, 但经PCR扩增后, 可用于鉴定胎儿性别和Rh血型、性连锁遗传性疾病和地中海贫血等基因病的诊断和染色体异常的筛查, 并为一些遗传性疾病的产前治疗提供依据, 因此具有重要的临床意义。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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