引用本文
张岳春, 凌卫明, 仇雅雯. 高效液相色谱法同时测定人血浆中氟西汀和喹硫平浓度. 2012, 27(11): 925-928
ZHANG Yuechun, LING Weiming, QIU Yawen.. Simultaneous determination of the concentrations of fluoxetine and quetiapine in human plasma by HPLC. Labratory Medicine, 2012, 27(11): 925-928  
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高效液相色谱法同时测定人血浆中氟西汀和喹硫平浓度
张岳春, 凌卫明, 仇雅雯
南京医科大学附属无锡市精神卫生中心检验科,江苏 无锡 214151
摘要
目的

建立同时测定人血浆中氟西汀和喹硫平浓度的高效液相色谱(HPLC)方法。

方法

采用HPLC同时测定血浆氟西汀和喹硫平浓度。色谱柱为Inertsil ODS-C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),流动相为0.05 mol/L醋酸铵-甲醇(体积比22 ∶78),流速为0.8 mL/min,检测波长为254 nm,柱温为40 ℃,萃取剂为乙酸乙酯-二氯甲烷(体积比77 ∶23),内标物为卡马西平。

结果

卡马西平和喹硫平、氟西汀色谱峰完全分离,峰形良好,保留时间分别为4.91、6.53和7.48 min,血浆中杂质对测定不产生干扰。氟西汀在10~480 μg/L、喹硫平在 20~1 600 μg/L范围内线性关系良好( r值分别为0.990 5、0.992 9);当信噪比(S/N)=3时,检测限分别为5、8 μg/L。氟西汀和喹硫平低、中、高3种浓度绝对回收率均>75%,相对回收率>95%,日内、日间相对标准偏差( RSD)均<10%。

结论

该方法灵敏、准确、成本低廉,可用于临床氟西汀与喹硫平的血药浓度监测和药物动力学研究。

关键词: 氟西汀; 喹硫平; 高效液相色谱法; 血药浓度
中图分类号:R971 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)11-0925-04
Simultaneous determination of the concentrations of fluoxetine and quetiapine in human plasma by HPLC
ZHANG Yuechun, LING Weiming, QIU Yawen.
Department of Clinical Laboratory, Wuxi Mental Health Center Affiliated to Nanjing Medical University,Jiangsu Wuxi 214151,China
Abstract
Objective

To establish a method for determining the concentrations of fluoxetine and quetiapine simultaneously in human plasma by high performance liquid chromatography (HPLC).

Methods

The plasma concentrations of fluoxetine and quetiapine were determined by HPLC.The column was Inertsil ODS-C18 column (4.6 mm×150 mm,5 μm),the mobile phase was 0.05 mol/L ammonium acetate-methanol (volume ratio: 22 ∶78),the flow rate was 0.8 mL/min, the detection wavelength was 254 nm,the column temperature was kept at 40℃,the extractant was ethylacetate-dichloromethane (volume ratio: 77 ∶23),and the internal standard was carbamazepine.

Results

Chromatographic peaks of carbamazepine,quetiapine and fluoxetine were completely separated,and all peak shapes were good.The retention times were 4.91,6.53 and 7.48 min,respectively,and the interference of plasma impurities on the determination did not occur.The calibration curves showed good linearity in range of 10-480 μg/L for fluoxetine and 20-1 600μg/L for quetiapine ( r=0.990 5 and 0.992 9).When the signal-to-noise ratio(S/N)was 3,the detection limits were 5 and 8 μg/L,respectively.The absolute recoveries of fluoxetine and quetiapine in low,middle and high concentrations were >75%,and the relative recoveries were >95%.The relative standard deviation( RSD) of intra-day and inter-day were < 10%.

Conclusions

The method is sensitive,accurate and low-cost,and it can be used for clinical drug monitoring and pharmacokinetics studies of fluoxetine and quetiapine.

Keyword: High performance liquid chromatography; Fluoxetine; Quetiapine; Plasma drug concentration

氟西汀的商品名为百优解、奥麦伦等, 是一种新型抗抑郁药。喹硫平的商品名为启维、思瑞康等, 是一种非典型抗精神病药。临床上常联合氟西汀和喹硫平用于强迫症、难治性抑郁症等精神疾病的治疗[1, 2]。由于精神类药品副作用较大, 安全范围较窄, 因此有必要对上述药物进行血药浓度监测。有关氟西汀和喹硫平血药浓度的单独测定方法已有报道[3, 4, 5, 6], 但目前尚未见采用高效液相色谱(HPLC)法同时测定这2种药物血药浓度的报道。为此, 我们建立了一种用于同时测定血浆中这2种药物浓度的HPLC方法。

材料和方法
一、对象

选取2012年2月在南京医科大学附属无锡市精神卫生中心住院治疗的抑郁症患者3例, 其中男1例, 女2例, 年龄21~74岁。3例患者同时口服氟西汀和喹硫平, 氟西汀剂量均为40 mg/d, 喹硫平剂量分别为12.5、 100.0、 400.0 mg/d。 2周后早晨服药前空腹采血, 分离血浆, 测其血药浓度。

二、仪器和试剂
1. 仪器

日本岛津LC-20A高效液相色谱仪, 包括SPD-20A紫外分光检测器、LC-20AT泵、7725i六通进样器和LC Solution系统工作站。XS105电子分析天平, S20 pH计(梅特勒-托利多仪器公司), 离心机, 旋涡混合器, 超声脱气机, 氮吹仪, 水浴箱等。

2. 试剂

甲醇(美国TEDIA公司, 批号1012900)。醋酸铵(无锡展望公司, 批号 1006189)、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙酸、氢氧化钠等均为国产分析纯。水为超纯水。标准品购自中国药品生物制品检定所:氟西汀批号100513-200401、喹硫平批号100815-200501、内标物卡马西平批号 1001142-20100401。

三、方法
1. 色谱条件

Inertsil ODS-C18色谱柱(4.6 mm× 150 mm, 5 μ m, 日本岛津公司), 通用型保护柱, 流动相为0.05 mol/L醋酸铵-甲醇(22 ∶ 78)(乙酸调pH值至6.5), 用前经微孔滤膜过滤并超声波脱气, 流速0.8 mL/min, 柱温40 ℃, 检测波长254 nm, 进样量20 μ L。

2. 标准曲线的制备

精密称取氟西汀、喹硫平标准品适量, 用甲醇溶解配制浓度为1 g/L的标准品储备液, 以此储备液为母液配制系列浓度的标准品溶液。同样方法配得1 g/L的卡马西平溶液, 并稀释成5 mg/L的浓度, 作为内标溶液使用。取试管8个, 分别加入20 μ L不同浓度的氟西汀和喹硫平标准品溶液, 氮气吹干后再加空白血浆1.0 mL, 振荡数秒, 使血浆氟西汀的浓度分别为10、20、40、60、80、120、240、480 μ g/L, 血浆喹硫平的浓度分别为20、40、80、100、200、400、800、1 600 μ g/L, 准确加入5 mg/L内标液20 μ L, 旋涡混匀, 加甲醇0.5 mL, 旋涡混匀, 4 000× g离心3 min, 将上清液移入另一10 mL带盖锥形离心试管中, 加2 mol/L NaoH 0.3 mL, 旋涡混匀, 再加萃取剂乙酸乙酯-二氯甲烷(体积比77 ∶ 23)3.0 mL, 密塞, 旋涡混匀 3 min, 4 000× g离心5 min。吸取上清液置试管中, 于40 ℃水浴箱内氮气吹干。进样前加60 μ L流动相, 快速振荡数秒溶解残渣, 20 μ L进样分析。

3. 血浆标本处理

吸取含氟西汀与喹硫平的血浆标本1.0 mL置试管内, 加内标等操作步骤同方法中的“ 2.标准曲线的制备” 。

四、统计学方法

LC Solution工作站进行色谱数据的获取和处理。计量数据以 x̅± s表示, 采用Excel和SPSS 16.0软件进行数据处理。

结果
一、色谱图

卡马西平和喹硫平、氟西汀色谱峰完全分离, 峰形良好, 保留时间分别为4.91、6.53和7.48 min, 血浆中杂质对测定不产生干扰。见图1。

图1 高效液相色谱图

二、线性关系和灵敏度

以氟西汀、喹硫平峰面积和内标卡马西平峰面积的比值(X)对标准品浓度(Y)进行线性回归分析。氟西汀在10~480 μ g/L范围内线性良好, 标准曲线回归方程为Y=18.172 5X-3.254 1, 相关系数(r)=0.990 5; 当信噪比(S/N)=3时, 检测限可达到5 μ g/L。喹硫平在20~1 600 μ g/L范围内线性良好, 标准曲线回归方程为Y=9.256 4X+2.546 2, r=0.992 9, 当S/N=3时检测限可达到8 μ g/L。

三、回收率及精密度试验

取空白血浆, 分别制备低、中、高浓度血浆标准品溶液(氟西汀为10、60、240 μ g/L; 喹硫平为20、200、800 μ g/L)。按文献[7]方法进行实验。2种药物低、中、高3种浓度绝对回收率均> 75%, 相对回收率> 95%, 日内、日间相对标准偏差(RSD)均< 10%。结果见表1。

表1 回收率及日内、日间精密度
四、临床应用

3例抑郁症患者服药2周后检测其血药浓度, 氟西汀分别为83、53、40 μ g/L, 喹硫平分别为34、172、371 μ g/L。说明所建立的HPLC法可行。

讨论

抗抑郁药物氟西汀是选择性5-羟色胺再摄取阻滞剂, 毒副作用相对较小, 患者耐受性好。非典型抗精神病药物喹硫平具有抗抑郁、抗焦虑作用[8]。临床上常联用氟西汀和喹硫平治疗难治性抑郁症, 起效快, 疗效好[2]。国外有研究显示:喹硫平合用抗抑郁药, 会显著增加喹硫平的血药浓度[9]。因此, 通过测定喹硫平和氟西汀血药浓度并运用药物动力学原理制定个体化给药方案, 以提高疗效, 减少或避免毒性反应, 这对于指导临床用药有重要价值。

氟西汀和喹硫平结构中都有苯环, 紫外吸收明显。吸取氟西汀与喹硫平标准品溶液在190~400 nm波长范围内进行紫外扫描, 发现氟西汀在210、254 nm有强吸收峰。喹硫平在210、256 nm 处有强吸收峰。因210 nm靠近末端吸收, 容易受到溶剂和杂质的干扰, 因此本研究的波长选择254 nm。

文献[4, 6]报道, 使用高效液相-串联质谱法分别测定氟西汀和喹硫平血药浓度, 灵敏度很高, 但这些方法需配置昂贵的仪器设备, 不易普及。药物提取时使用固相萃取技术[5, 6], 成本较大。刘文宪等[3]使用有机溶剂直接萃取。然而本研究发现使用有机溶剂直接萃取, 杂质较多, 影响药物色谱分析且容易损坏色谱柱。故本研究先用甲醇沉淀, 再用2 mol/L NaOH溶液进行碱化, 使2种药物在溶液中处于游离状态, 最后用混合有机溶剂进行提取。此法萃取回收率高且提取物纯度较高, 药物分析时基线稳定, 氟西汀和喹硫平检测限分别为5和8 μ g/L, 能满足临床工作需要。文献[4, 5]流动相中使用乙睛, 而本研究改用毒性较小的甲醇, 有利于保护环境。文献[3]中没有提及流动相的pH值。而本研究发现流动相的pH值对药物的峰形及出峰时间有较大影响。pH值过低, 药物出峰前移, 目的峰分离困难, 峰顶端出现分叉; pH值过高, 药物出峰时间延后, 且峰形展宽, 拖尾严重。在本研究条件下, pH值以6.5左右为宜。氮气吹干后用流动相复溶, 可减少背景反差带来的杂峰干扰。文献[5]使用外标法测定, 结果准确性受到影响。文献[3]中使用安定作为内标物, 而临床上抑郁症患者睡眠不佳时有时会加用安定类药物。因此这些物质不宜做为内标的首选。经综合考虑内标结构、性质、吸收曲线等因素后, 最终选用了患者不常联用的卡马西平作为内标物, 避免了患者血清本身对测定结果的影响, 扩大了方法在实际工作中的应用范围。

本研究通过改良萃取方法, 选择合适的pH值和内标物, 优化各种实验条件, 建立了同时测定人血浆中氟西汀和喹硫平浓度的HPLC法, 具有成本低廉、灵敏度高、准确性好、线性范围宽、应用范围广等优点, 可用于临床氟西汀和喹硫平的血药浓度测定及药动学研究。

致谢:本研究实验过程得到南京医科大学附属无锡市精神卫生中心中心实验室袁建民主任的技术指导, 在此表示衷心感谢!

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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