引用本文
李晓斐. 乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建. 2012, 27(11): 921-924
LI Xiaofei. Establishment of hepatitis B virus X gene eukaryotic expression vector. Labratory Medicine, 2012, 27(11): 921-924  
Permissions
Copyright©2012, 《检验医学》编辑部
《检验医学》编辑部
乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建
李晓斐
青岛市传染病医院检验科 山东青岛 266033

作者简介:李晓斐,男,1957年生,学士,副主任技师,主要从事分子生物学研究。

摘要
目的

构建含有乙型肝炎病毒(HBV)X基因的真核表达载体,并对其表达进行鉴定。

方法

用聚合酶链反应(PCR)方法扩增X基因序列,对pcDNA6(+)载体及X基因PCR产物双酶切并转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,并对其进行双酶切和测序鉴定,构建HBV X基因真核表达载体pcDNA6(+)-HBx。以多聚乙烯酰胺(PEI)法将其转染到HepG2细胞,Western Blot鉴定目的蛋白。

结果

pcDNA6-HBx酶切后,琼脂糖电泳可见到HBx基因片段,经序列测定其含有完整的X基因片段;Western Blot结果显示pcDNA6(+)-HBx能在HepG2细胞中表达X蛋白。

结论

成功构建了真核表达载体pcDNA6(+)-HBx,并能在HepG2细胞中表达X蛋白,为进一步研究HBV X基因与慢性乙型肝炎及肝癌的关系提供便利条件。

关键词: 乙型肝炎病毒; X基因; 真核表达
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)11-0921-04
Establishment of hepatitis B virus X gene eukaryotic expression vector
LI Xiaofei
Department of Clinical Laboratory,Qingdao Infection Diseases Hospital,Shandong Qingdao 266033,China
Abstract
Objective

To establish hepatitis B virus (HBV)X gene eukaryotic expression vector and identify its expression.

Methods

Polymerase chain reaction (PCR)was used to amplify X gene sequence, and the pcDNA6(+)vector and X gene PCR product double enzyme digestion transformed into Escherichia coli DH5 alpha.The positive clones were screened, and the double enzyme digestion and DNA sequencing were used to establish HBV X gene eukaryotic expression vector pcDNA6(+)-HBx.By polyetherimide (PEI)method, the transformation into HepG2 cells was performed, and Western blot identification of target protein was carried out.

Results

After pcDNA6-HBx enzyme digestion, agarose gel electrophoresis found HBx gene fragment, and sequencing results showed containing the complete X gene fragment.Western blot results showed that the pcDNA6(+)-HBx in HepG2 cells expressed X protein.

Conclusions

The eukaryotic expression vector pcDNA6(+)-HBx is established successfully, and there is X protein expression in HepG2 cells. It provides convenience for the further study of HBV X gene with chronic hepatitis and hepatocellular carcinoma.

Keyword: Hepatitis B virus; X gene; Eukaryotic expression

乙型肝炎是一种高发传染病, 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染后有5%~10%的患者将发展为慢性肝炎(chronic hepatitis, CH), 而这又是肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)发生的高危险因素(几率比正常人大100倍)[1, 2]。HBV基因具有4个开放式阅读框架(open reading frame, ORF), 其中X基因是最小的开放式阅读框架, 位于第1 374~1 835位核苷酸之间, 全长462bp, 编码154个氨基酸, 为相对分子质量17 000的X蛋白。目前认为HBx是一种多效转录激活因子, 其本身不能与双链DNA直接结合, 而是通过蛋白与蛋白之间的相互作用来行使功能。HBx基因是HBV复制和扩散所必需的基因, 在乙肝慢性化和HCC的发生中具有重要作用[3, 4]。为了进一步研究X基因的生物学特性及其与HCC发生的关系, 我们构建了HBV X基因的真核表达载体, 并在真核细胞中进行表达。

材料和方法
一、材料

乙型肝炎患者血清采自青岛市传染病医院门诊及住院患者。DH5α 由青岛市传染病医院检验科保存, HepG2细胞由青岛大学微生物实验室惠赠; pcDNA6(+)质粒购自Invitrogen公司; 多聚乙烯酰胺(PEI)购自Sigma公司; dNTP、Taq酶、T4连接酶、EcoRⅠ 、HindⅢ 、100 bp DNA Marker购自上海生物工程公司; 鼠抗人HBV X一抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗购于晶美生物工程公司; Western Blot试剂盒购自 RPL 公司; RPMI 1 640和胎牛血清购自Gibco公司; 引物由上海生物工程公司合成提供。

二、方法
1. 真核表达载体pCDNA6(+)-HBx的构建

(1)血清HBV DNA提取:100 μ L血清加入300 μ L TES液混匀, 60℃消化1 h, 等体积苯酚/氯仿及氯仿抽提各1次, 上清加入2倍体积无水乙醇及1/10体积3 mol/L醋酸钠(pH值4.8)沉淀病毒DNA, 再以70%乙醇漂洗1次, 并溶于20μ L灭菌双蒸水中; (2)PCR扩增X基因:引物设计, 扩增X基因片段。用 Primer引物设计软件进行软件设计, 分别在上游引物和下游引物5'端添加限制性内切酶EcoR Ⅰ 和Hind Ⅲ 酶切位点, 根据载体校正读码框, 保证终止密码正常读码, 并于引物两端加入相应数目保护碱基。所设计引物如下:primer1: 5'-GTA TAA GCT TAC CAT GGC TGC TAG GC-3'; Primer 2: 5'-TGA AGA ATT CGA TCT CAG TGG TGG T- 3'。在25μ L反应体系中加入2.5μ L 10× 反应缓冲液, 0.5μ L 1 mmol/L dNTP, HBV DNA模板1.0 μ L, 两引物各0.5 μ L, Taq酶0.2 μ L, MgCl 21.8 μ L, 补水至25 μ L。反应条件:95 ℃预变性3 min, 94 ℃变性60 s, 56 ℃退火30 s, 72 ℃延伸60 s, 40个循环, 72 ℃再延伸 10 min。进行琼脂糖凝胶电泳鉴定; (3)载体pcDNA6(+)-HBx构建:将PCR产物与质粒pcDNA6(+)用EcoR Ⅰ 和Hind Ⅲ 双酶切后, 琼脂糖凝胶电泳, 回收约500 bp目的基因片段与pcDNA6(+)质粒片段, 用T4连接酶连接, 构建载体pcDNA6(+)-HBx, 转化感受态细胞DH5α , 经EcoRⅠ 和Hind Ⅲ 双酶切后, 琼脂糖凝胶电泳证实含有目的基因片段, 再经测序进一步鉴定。

2. 重组质粒的表达及鉴定

(1)细胞培养:转染前16 h将HepG2细胞(5× 104/mL)接种于6孔板中, 置37 ℃、5% CO2, 10%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养; (2)细胞转染:设空白对照组、pcDNA6(+)空质粒对照组和 pcDNA6(+)-HBx实验组。吸弃细胞培养液, 加入无血清1640 1 mL/孔, 再加入C液100 μ L。37 ℃培养箱放置1 h后, 每孔加入110 μ L胎牛血清, 37 ℃、5% CO2培养24h~48h, 分别收集细胞和上清液; (3)Western Blot鉴定X蛋白表达 取转染后48 h 瞬时表达细胞, 消化后于试管内离心, 去上清, 用PBS洗涤2次, 加入十二烷基磺酸钠(SDS)上样缓冲液, 100 ℃煮沸 3 min, 冷却后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳及Western Blot检测表达蛋白。

3. Western Blot鉴定X蛋白表达

取转染后48h 瞬时表达细胞, 消化后于试管内离心, 去上清, 用PBS洗涤2次, 加入SDS上样缓冲液, 100 ℃煮沸 3 min, 冷却后进行SDS-PAGE电泳及Western Blot检测表达蛋白。

结果
一、X基因真核载体的构建
1. PCR扩增X基因 PCR扩增后, 电泳可见约500 bp处有一明显条带, 见图1。

图1 HBx基因琼脂糖电泳结果（注:1. 基因PCR扩增产物; 2. DNA Marker）

2. HBx基因表达载体pcDNA6(+)-HBx的双酶切鉴定

重组质粒pcDNA6(+)-HBx经Hind Ⅲ 、EcoR I双酶切, 出现2个片段, 大片段与pcDNA6空质粒迁移率接近, 小片段位于DNA Mark约500 bp处, 与X基因大小一致。测序结果表明, 重组质粒pcDNA6(+)-HBx含有完整的正确的X基因片段。见图2。测序结果表明, 重组质粒pcDNA6(+)-HBx含有完整的正确的X基因片段。

图2 HBx基因琼脂糖电泳结果（注: 1.为pcDNA6(+)空质粒; 2.为pcDNA6(+)-X重组质粒; 3.为HindⅢ 、EcoRⅠ 双酶切pcDNA6(+); 4.为HindⅢ 、EcoRⅠ 双酶切pcDNA6(+)-HBx; 5.DNA Mark）

二、真核表达载体pcDNA6(+)-HBx在HepG2细胞中的表达

将pcDNA6(+)-HBx和pcDNA6(+)分别转染HepG2细胞。转染后48 h做Western Blot, pcDNA6(+)-HBx转染组在17 000处出现了阳性条带, 而在pcDNA6(+)转染组与HepG2细胞对照组没有阳性条带。表明所构建的真核表达载体pcDNA6(+)-HBx可以在真核细胞内表达。见图3。

图3 HepG2细胞表达X蛋白Western Blot结果（注: 1.为pcDNA6(+)-HBx转染的HepG2细胞; 2.为pcDNA6(+)转染的HepG2细胞; 3.为HepG2细胞）

讨论

乙型肝炎是严重威胁人类健康的世界性传染病。据世界卫生组织(WHO)报道, 我国乙型肝炎表面抗原阳性患者人数在1.2亿以上, 每年因HBV感染致死的人数有100万左右[5]。HBx基因表达产物X蛋白具有多种生物功能, 可通过与多种转录因子间的相互作用, 发挥对多种病毒和细胞因子的激活作用, 如原癌基因(c-myc、N-myc等)、转录因子(AP-1, NF-κ B等)、HBV增强子等; 也可激活RAS、Fas L、STAT-3及MAKP/JAK途径等, 在HCC的发病过程中起核心作用[6, 7]。X蛋白不仅是一种复杂的反式激活因子, 而且可通过影响正常的细胞周期, 干扰DNA的修复, 调节肝细胞增殖、分化和凋亡等, 其影响细胞凋亡[8, 9]的作用是通过参与多条信号传导通路发挥的。关于X蛋白在细胞凋亡中的作用, 目前有两种截然相反的观点, 一种观点认为X蛋白可诱导细胞凋亡, 另一种观点认为其可抑制细胞凋亡。Lee等[10]发现HBx可以影响宿主的免疫功能。同时, 由于HBV感染的宿主专一性很强, 因此, 大大限制了我们对肝炎、肝癌的研究和防治。利用现代分子生物学技术, 我们便可将其转染到细胞中稳定、持续地表达, 在体外细胞水平上了解并分析X基因的表达及其产物的生物学功能。我们的研究利用基因重组技术构建了HBx基因的真核表达载体pcDNA6(+)-HBx, 并筛选到了稳定表达X蛋白的HepG2细胞, 表明HBx基因表达载体pcDNA6(+)-HBx可在真核细胞中表达, 为进一步研究HBx蛋白在肝癌发生中的致病作用奠定了前期实验基础。

HBX 蛋白引发的促或抗凋亡作用可能因其作用不同阶段和不同细胞环境而异。现在的许多研究结果仅是针对不同的细胞株和不同的 HBX分子伴侣, 而且未能完全考虑到HBX在不同时空上的差异。加上多细胞机体的信号调节系统是复杂多样的, 研究者也仅能在相对理想的条件下获得结果。因此, HBX 蛋白对机体细胞凋亡的调节作用和确切机制还有待进一步实验研究。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
1 [ 1 ] Beasley RP. Hepatitis B virus. The major etiology of hepatocellular carcinoma[J]. Cancer, 1988, 61(10): 1942-1956. [本文引用:1]
2 [ 2 ] Zentgraf H, Herrmann G, Klein R, et al. Mouse monoclonal antibody directed against hepatitis B virus X protein synthesized in Escherichia coli: detection of reactive antigen in liver cell carcinoma and chronic hepatitis[J]. Oncology, 1990, 47(2): 143-148. [本文引用:1]
3 [ 3 ] Chen HS, Kaneko S, Girones R, et al. The woodchuck hepatitis virus X gene is important for establishment of virus infection in woodchucks[J]. J Virol, 1993, 67(3): 1218-1226. [本文引用:1]
4 [ 4 ] Zoulim F, Saputelli J, Seeger C. Woodchuck hepatitis virus X protein is required for viral infection in vivo4 ] Zoulim F, Saputelli J, Seeger C. Woodchuck hepatitis virus X protein is required for viral infection in vivo[J]. J Virol, 1994, 68(3): 2026-2030. [本文引用:1]
5 [ 5 ] Arbuthnot P, Kew M. Hepatitis B virus and hepatocellular carcinoma5 ] Arbuthnot P, Kew M. Hepatitis B virus and hepatocellular carcinoma[J]. Int J Exp Pathol, 2001, 82(2): 77-100. [本文引用:1]
6 [ 6 ] Wang XZ, Chen XC, Chen YX, et al. Overexpression of HBxAg in hepatocellular carcinoma and its relationship with Fas/FasL system[J]. World J Gastroenterol, 2003, 9(12): 2671-2675. [本文引用:1]
7 [ 7 ] Diao J, Khine AA, Sarangi F, et al. X protein of hepatitis B virus inhibits Fas-mediated apoptosis and is associated with up-regulation of the SAPK/JNK pathway[J]. J Biol Chem, 2001, 276(11): 8328-8340. [本文引用:1]
8 [ 8 ] Balsano C, Billet O, Bennoun M, et al. Hepatitis B virus X gene product acts as a transactivator in vivo[J]. J Hepatol, 1994, 21(1): 103-109. [本文引用:1]
9 [ 9 ] Lee S, Tarn C, Wang WH, et al. Hepatitis B virus X protein differentially regulates cell cycle progression in X-transforming versus nontransforming hepatocyte (AML12)cell lines[J]. J Biol Chem, 2002, 277(10): 8730-8740. [本文引用:1]
[10] Lee DK, Park SH, Yi Y, et al. The hepatitis B virus encoded oncoprotein pX amplifies TGF-beta family signaling through direct interaction with Smad 4: potential mechanism of hepatitis B virus-induced liver fibrosis[J]. Genes Dev, 2001, 15(4): 455-466. [本文引用:1]