引用本文
孙康德, 李洁琼, 陈福祥, 陈军, 王宇. 食源性沙门菌感染的实验室诊断及鼠伤寒沙门菌同源性分析. 2012, 27(11): 913-916
SUN Kangde, LI Jieqiong, CHEN Fuxiang, CHEN Jun, WANG Yu. Laboratory diagnosis in food-borne diseases caused by Salmonella and homology analysis in Salmonella typhimurium . Labratory Medicine, 2012, 27(11): 913-916  
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食源性沙门菌感染的实验室诊断及鼠伤寒沙门菌同源性分析
孙康德1, 李洁琼1, 陈福祥1, 陈军2, 王宇2
1. 上海交通大学医学院附属第九人民医院检验科,上海 200011
2. 上海黄浦区疾病控制中心微生物科,上海 200011

作者简介:孙康德,男,1966年生,硕士,副主任技师,主要从事微生物检测和细菌耐药性研究。

摘要
目的

用改良的沙门菌分离鉴定方法提高肠道沙门菌的检出率,初步掌握上海市主要沙门菌流行状况及菌型分布,建立沙门菌脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型数据库,以便在发生沙门菌病时快速溯源,为控制该病的传播提供技术支撑。

方法

用改良的沙门菌鉴定方法对可疑肠道粪便标本进行分离、培养和鉴定;用PFGE对鼠伤寒沙门菌进行DNA分子分型,分析试验菌株的同源性。

结果

用改良的沙门菌鉴定方法分离出的沙门菌中以肠炎沙门菌为主,占全部菌株的42.1%,其次为鼠伤寒沙门菌,占13.2%。PFGE分析的10株鼠伤寒沙门菌分成A、B 2个PFGE型,其中A型菌株6株,B型菌株4株。A型菌株有4个亚型。

结论

改良的沙门菌鉴定方法可以有效提高沙门菌的检出率;PFGE是一种研究鼠伤寒沙门菌分子分型的有效方法,鼠伤寒沙门菌的分型结果显示了相对集中的亲缘关系。

关键词: 沙门菌; 改良分离鉴定方法; 脉冲场凝胶电泳; 分子分型
中图分类号:R378.2 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)11-0913-04
Laboratory diagnosis in food-borne diseases caused by Salmonella and homology analysis in Salmonella typhimurium
SUN Kangde1, LI Jieqiong1, CHEN Fuxiang1, CHEN Jun2, WANG Yu2
1. Department of Clinical Laboratory,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China
2. Department of Clinical Microbiology,Shanghai Huangpu District Center for Disease Control and Prevention,Shanghai 200011,China
Abstract
Objective

To increase the detection rate of Salmonella in intestinal tract by the improved isolation and identification method, and to fundamentally understand the major Salmonella and its molecular typing in Shanghai,establish the database of pulsed-field gel electrophoresis (PFGE)typing for rapid source-tracing and control dissemination of the disease during Salmonella outbreaks.

Methods

The improved isolation and identification method was used to detect suspected Salmonella in fecal specimens. PFGE was used to perform molecular typing of Salmonella typhimurium.

Results

Salmonella enteritidis was main among the isolates of Salmonella by the improved isolation and identification method,accounting for 42.1%.The second was Salmonella typhimurium,accounting for 13.2%.Two distinct DNA fragment profiles,PFGE type A and B,were observed,including type A: 6 isolates and type B: 4 isolates respectively.Type A could be subclassified further into 4 subtypes.

Conclusions

The improved isolation and identification method could effectively increase the detection rate of Salmonella in fecal specimens.PFGE is an effective method to study the molecular typing.The research shows relatively close kinship in molecular typing of Salmonella typhimurium.

Keyword: Salmonella; Improved isolation and identification method; Pulsed-field gel electrophoresis; Molecular typing

沙门菌是引起食源性疾病的重要病原菌, 全球每年发生食源性疾病病例高达数亿例[1]。随着食品贸易增长和流通的全球化、新的食品加工技术的应用、人们饮食习惯的改变等, 沙门菌性食源性疾病发病率可能会继续上升。因此, 提高沙门菌的检出率及进行其同源性分析是非常必要的。但传统的沙门菌鉴定分型方法对沙门菌的检出率低, 且只能对细菌从表型上进行分析研究, 而对于决定这些表型的遗传特性则未涉及[2], 已不能满足疾病临床诊断和流行病学调查的需要。我们用改良的沙门菌鉴定方法分离了10株鼠伤寒沙门菌, 应用分子生物学技术, 从分子水平上去认识、观察、研究这些细菌的变异[3, 4], 对其进行同源性分析, 对于控制疾病的传播起到至关重要的作用。脉冲场凝胶电泳(PFGE)是近年来快速发展的一种对微生物进行分子分型的研究技术, 该技术对于细菌的分子分型具有重复性好、结果稳定可靠、区分能力强等优点[5, 6, 7], 对病原的追溯、确定传播途径具有重要意义。

材料和方法
一、材料
1. 菌株来源

收集2009至2011年上海第九人民医院肠道科符合下列条件的食源性沙门菌感染的患者和带菌者的粪便进行分离培养。患者筛选条件:凡24 h内大便次数3次及以上, 粪便性状改变者视为腹泻患者; 发热、体温38 ℃及以上, 伴有头痛、全身乏力或呕吐、腹痛、粪便性状为黄色水样便或黄绿色水样便。10株鼠伤寒沙门菌来自于2009至2011年上海第九人民医院肠道科食源性沙门菌感染的患者和带菌者。PFGE的标准对照菌株H9812来自于中国疾病预防控制中心传染病控制所。

2. 主要设备

全自动微生物分析系统VITEK32为法国生物梅里埃公司产品, 脉冲场电泳仪为CHEF MapperXA型, 凝胶成像仪为Gel Doc XR+型, 均为美国Bio-Rad公司产品。

3. 主要培养基、试剂和溶液

羊血琼脂平板购自于上海伊华医学科技有限公司, 沙门菌科玛嘉显色培养基(CSA)、木糖赖氨酸去氧胆酸钠琼脂平板(XLD)、改良磺绿增菌液(SBG)、简易肠道发酵管1、简易肠道发酵管2、H2S试纸、Ⅰ 试纸均由上海市疾病预防控制中心提供, 由上海科玛嘉微生物技术有限公司生产。 VITEK32 GNI板条为法国生物梅里埃公司产品。全套沙门菌属诊断血清为宁波天润生物药业有限公司产品, 有效期内使用。限制性内切酶XbaI为Takara公司产品, PFGE专用琼脂糖Seakem Gold agarose为Cambrex Bio Science Rockland公司产品, 蛋白酶K为Promega公司产品。细胞悬浮缓冲液(CSB)和细胞裂解缓冲液(CLB)均由中正惠东医疗技术有限公司生产。

二、方法
1. 改良的沙门菌鉴定方法

第1天:挑取可疑标本划线接种于CSA、XLD各1块, 随后将拭子于SBG肉汤中反复搅动后插回原运送管中留样备用。分离平板和增菌肉汤管置(37± 0.5)℃增菌培养18~24 h; 第2天:观察CSA和XLD上菌落形态, 如CSA平板上有典型的酒红色菌落、XLD平板上有典型的中心黑色边缘较透明的无色或淡红色菌落的可疑菌落生长者, 以接种针或环挑取3个疑似菌落分别转种到简易肠道发酵管; 随后取出增菌液标本以接种环在表面取1满环, 分别接种CSA、XLD各1块。将简易肠道发酵管和增菌平板置(37± 0.5)℃培养18~24 h; 第3天:首先观察增菌平板的疑似菌落情况, 按照第2天的菌落判断接种简易肠道发酵管, 其次观察直接平板菌落的简易肠道发酵管结果。将增菌平板的简易肠道发酵管置(37± 0.5)℃培养18~24 h; 第4天:观察简易肠道发酵管结果, 如初步生化结果符合的可疑菌落最终均由VITEK鉴定为沙门菌, 然后进行血清学凝集, 同时设生理盐水对照。

2. PFGE

(1)细菌定量:取适量细菌, 均匀悬浮于2 mL CSB溶液中, 于分光光度计上比色, 用bioMé rieuxVitek 比浊仪调整菌液的浓度, 使数值控制在4.0~4.5之间。H9812与标本同样处理; (2)制备琼脂糖细菌包埋胶块:取400 μ L细菌悬浮液于1.5 mL Eppendorf管中, 置于37 ℃水浴孵育5 min。每管加入20 μ L蛋白酶K, 使其终浓度为0.5 g/mL, 混匀。加入400 μ L事先已熔化并在56 ℃水浴保温的1% Seakem Gold琼脂糖溶液(含1%十二烷基硫酸钠), 轻轻混匀后加入模具, 避免气泡产生, 在室温下凝固15 min; (3)细菌裂解:在CLB中加入蛋白酶K, 使其终浓度为0.1 g/mL, 每个Falcon管加入50 mL。从模具中取出已凝固的细菌包埋胶块放入到Falcon管中, 保证胶块在液面以下, 放在事先准备好的54 ℃水浴摇床中孵育2 h, 转速约2.5 g左右; (4)洗涤细菌包埋胶块:轻轻倒掉蛋白酶K-CLB混合液, 加入15 mL已经50 ℃预热的纯水。于50 ℃水浴摇床洗涤10 min, 摇床转速2.5 g。按此条件再洗1次。用三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(TE)缓冲液代替纯水, 同样条件洗涤3次, 倒掉TE; (5)限制性内切酶酶切:将洗涤过的胶块切成2 mm宽的小胶条, 放入事先已加入200 μ L胶块平衡液(不含酶的酶切缓冲液)的1.5 mL Eppendorf管中, 确保胶块在液面下, 37 ℃水浴孵育10 min。小心吸出胶块平衡液, 加入200 μ L酶切溶液, 37 ℃水浴中孵育3 h, 吸出溶液。每管加入200 μ L 0.5× 三羟甲基氨基甲烷-硼酸(TBE)电泳缓冲液平衡5 min; (6)加样及制备琼脂糖电泳胶:把平衡过的胶块按顺序放在梳子齿上, 每隔4个标本加1个对照菌胶块(H9812)。把梳子放入胶槽, 使胶块与胶槽的底面相接触, 确保所有的胶块在一条线上, 室温风干3~5 min。缓慢倒入100 mL熔化后在55~60 ℃平衡的1% Seakem Gold琼脂糖溶液, 室温凝固30 min左右; (7)电泳、染色及成像:电泳胶放入电泳槽中, 加2 200 mL 0.5× TBE电泳缓冲液。电泳初始电流通常为120~145 ma, 脉冲时间为2.16~63.8 s, 电压梯度为6 V/cm, 电场夹角120° , 电泳时间19 h, DNA片段长度范围30~700 kb, 电泳温度为14 ℃。电泳后将胶放入含1 μ g/mL 溴化乙锭(EB)染液中染15~30 min。用凝胶成像仪成像并转换成TIFF图像格式保存。

三、 统计学方法

应用NTSYSpc 2.1软件进行聚类, 聚类方法应用UPGMA, 相似性系数计算选择Dice。

结果
一、 菌株生化、血清学鉴定结果

糖初筛试验结果显示, H2S(+/-)、动力(+)、吲哚(-)、蔗糖(-)。符合以上初步生化结果的可疑菌落最终均由VITEK32鉴定为沙门菌, 然后进行血清学凝集, 所有沙门菌株A~F(+), 其中32株肠炎沙门菌的血清学鉴定结果均为A~F(+)、O9(+)、Hg(+)、Hm(+); 10株鼠伤寒沙门菌的血清学鉴定结果均为A~F(+)、O4(+)、Hi(+); 生理盐水对照(-)。

二、 在2009至2011年期间

用改良的沙门菌分离鉴定方法共检出76株沙门菌, 有20余种, 以肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌为主。改良沙门菌鉴定方法分离的菌株及其所占百分比见表1。

表1 改良沙门菌鉴定方法分离的菌株及其所占百分比
三、菌株的PFGE分型结果

本次PFGE试验主要针对10株鼠伤寒沙门菌, 鼠伤寒沙门菌经XbaI酶切后PFGE, 每个菌株产生10~15条电泳带, 大小在30~668 kb之间, 根据电泳条带的不同, 10株鼠伤寒沙门菌被分成A、B 2个PFGE型, 2型图谱之间有6个条带的差异, 最主要的差别在于A型菌株的条带跨度在33.3~668.9 kb之间, 特别是在452.7~668.9 kb之间还有2~3条条带, 而B型菌株条带跨度在54.7~452.7 kb之间。10株鼠伤寒沙门菌中A型菌株6株, 占全部菌株的60.0%, B型菌株4株, 占40.0%。A型之内又可以分出4个亚型, 其中A1亚型菌株有3株, A2、A3、A4亚型各有1株。见图1。

图1 10株鼠伤寒沙门菌PFGE图谱注:1、5、10、15为Marker; 2、11、12为A1亚型; 3为A2亚型; 8为A3亚型; 9为A4亚型; 4、6、7、13为B型菌株; 14为志贺氏菌, 非本次试验用

讨论

SS平板、克氏双糖管分离培养和鉴定沙门菌的传统方法对沙门菌的检出率较低, 现用改良的沙门菌分离鉴定方法可有效提高沙门菌的检出率, 这是因为改良的沙门菌鉴定方法是直接分离结合增菌分离的方法, 并同时做CSA和XLD 2块平板, 而CSA和XLD平板比传统的SS平板对沙门菌的选择性更好, 简易肠道发酵管比克氏双糖管初步鉴定沙门菌属快速、准确。用改良的沙门菌鉴定方法分离出的沙门菌中排列第一的为肠炎沙门菌, 占全部菌株的42.1%, 其次为鼠伤寒沙门菌, 占13.2%, 其他沙门菌占44.7%。

应用拥有稀有酶切位点的限制性内切酶(如XbaI)将细菌染色体DNA切成不同大小的DNA片段进行PFGE, 根据酶切的电泳图谱进行聚类分析[8], 被认为是目前细菌分子流行病学研究的“ 金标准” , 该分型技术具有对细菌整个染色体进行分析、分辨率高、重复性好、结果稳定、易于标准化的特点, 现已成为许多致病菌的常规分型方法, 也是非伤寒沙门菌溯源的有力工具[9]。PFGE分型与流行病学资料相结合可增加对沙门菌食源性疾病的溯源和预警。

PFGE中内切酶的选用至关重要, 所采用的内切酶常为寡切点酶, 细菌全基因组DNA经这种酶酶切后的片段少而大, 适合PFGE。据国外资料报道, XbaI酶、Avrò 酶和SpeI酶均可用于鼠伤寒沙门菌PFGE中的酶切[10]。本试验用XbaI酶作为鼠伤寒沙门菌的内切酶, 产生的电泳条带较理想, 每株约产生12条长度在30~668 kb的电泳带, 说明本试验所选定的酶和设定的条件适合鼠伤寒沙门菌的分型。

本研究对2009至2011年从上海第九人民医院肠道科分离到的10株鼠伤寒沙门菌株经XbaI酶切后进行PFGE分析, 结果10株鼠伤寒沙门菌被分成A、B 2个PFGE型, 其中A型菌株6株, 占全部菌株的60.0%, B型菌株4株, 占40.0%。A型之内又可以分出4个亚型, 其中A1亚型3株, A2、A3、A4亚型各1株。

对PFGE酶切图谱结果进行解释, 当PFGE的酶切图谱间有同样的条带数, 且相应条带大小相同, 流行病学上即认为相同, 这种经PFGE证实的结果, 用其他方法检测不可能显示实质性的差异。如在PFGE中, 其他克隆株与爆发克隆具有一致的单一基因事件的改变, 如点突变、插入DNA缺失等, 在典型的情况下, 这种变化可导致2~3条条带的差异, 但若菌株间为2个独立的基因, 则会出现4~6条条带的差异(甚至更多条带的差异), 说明这些菌株间遗传基因不紧密相关, 流行病学上也不大可能相关。本研究中, A型与B型之间有多个条带不同, 故认为这2型基本没有亲缘关系。

本研究PFGE分析主要针对排列第2位的鼠伤寒沙门菌而非第1位的肠炎沙门菌, 首先是因为肠炎沙门菌的PFGE结果报道相对较多, 而对鼠伤寒沙门菌则少有报道, 其次由于试验经费的限制, 以后将会对肠炎沙门菌做进一步深入研究。本研究对鼠伤寒沙门菌分出了2个大型, 该结果与芬兰国立公共卫生研究所对鼠伤寒沙门菌进行的PFGE分型研究得到的图谱非常相似, 只是由于分型判定的标准不同, 因而分出的型别略少一些。分型结果显示了较强的亲缘关系, 虽然菌株数量较少, 不能依据本次结果得出鼠伤寒沙门菌的分子流行趋势, 但却提示了鼠伤寒沙门菌可能有相对集中的亲缘关系, 提供了今后的研究方向。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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