引用本文
曾方银, 张豫明, 张鹏, 林俐, 孙德华. 颗粒增强免疫透射比浊法测定甲胎蛋白方法学评价. 2012, 27(11): 896-899
ZENG Fangyin, ZHANG Yuming, ZHANG Peng, LIN Li, SUN Dehua. Methodology evaluation of particle-enhanced turbidimetric immunoassay for determining alpha-fetoprotein. Labratory Medicine, 2012, 27(11): 896-899  
Permissions
Copyright©2012, 《检验医学》编辑部
《检验医学》编辑部
颗粒增强免疫透射比浊法测定甲胎蛋白方法学评价
曾方银1, 张豫明2, 张鹏1, 林俐3, 孙德华1
1. 南方医科大学南方医院检验科,广东 广州 510515
2. 南方医科大学附属中西医结合医院检验科,广东 广州 510315
3. 广东省农垦中心医院检验科,广东 湛江 524500

作者简介:曾方银,男,1968年生,博士,主任技师,主要从事临床检验方法学研究。

通讯作者:孙德华,联系电话:020-62787123。

基金:广东省自然科学基金资助项目(9451051501003704); 广东省科技计划项目(2012A032200016)
摘要
目的

对定量测定甲胎蛋白(AFP)的颗粒增强免疫透射比浊法(PETIA)进行方法学评价。

方法

应用OLYMPUS AU5400全自动生化分析仪定量测定AFP,探讨该检测方法的精密度、试剂开瓶稳定性、检测下限、敏感性、线性范围、干扰和准确性;并与SIEMENS CENTAUR电化学发光法(ECLIA)定量测定临床新鲜血清AFP的结果进行相关性分析,同时对其参考区间进行验证。

结果

29.95和132.25 ng/mL的新鲜血清测定的批内变异系数( CV)分别为1.67%和1.52%;天间 CV分别为7.17%和7.84%;测定下限和敏感性分别为0.52和0.53 ng/mL;5.4~256 ng/mL范围内其测定的线性相关系数( r2)达0.999 4,回归方程为 Y=1.014 X+1.063 3;高、低水平浓度的定值质控血清测定的相对偏差分别为5.96%和8.40%,远小于卫生部临床检验中心AFP室间质评能力比对试验(PT)评价标准的“靶值±20%”;107例临床病例测定结果与SIEMENS化学发光分析仪测定的结果相关性良好, YECLIA=1.138 7 XPETIA+2.835 3( r2=0.992 1);一定程度的溶血、黄疸及脂血对该测定无明显干扰;20名健康体检者AFP测定结果均处于厂家推荐的参考区间内。

结论

PETIA测定AFP可作为一种简便易行、快捷价廉、准确可靠的临床常规检测方法,特别适合于健康体检时大规模筛查。

关键词: 颗粒增强免疫透射比浊法; 甲胎蛋白; 方法学评价
中图分类号:R446.61 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)11-0896-04
Methodology evaluation of particle-enhanced turbidimetric immunoassay for determining alpha-fetoprotein
ZENG Fangyin1, ZHANG Yuming2, ZHANG Peng1, LIN Li3, SUN Dehua1
1. Department of Clinical Laboratory, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangdong Guangzhou 510515, China
2. Department of Clinical Laboratory, Chinese and Western Medicine Hospital, Southern Medical University, Guangdong Guangzhou 510315, China
3. Department of Clinical Laboratory, Guangdong Agriculture and Reclamation Central Hospital, Guangdong Zhanjiang 524500, China
Abstract
Objective

To evaluate methodologically particle-enhanced turbidimetric immunoassay (PETIA)for determining quantitatively alpha-fetoprotein (AFP).

Methods

AFP was determined quantitatively by OLYMPUS AU5400 automatic biochemical analyzer, and the precision, reagent stability, detection low limit, sensitivity, linear range, interference and accuracy of this method were investigated. The correlation of fresh serum sample results between SIEMENS CENTAUR electro-chemiluminescence assay (ECLIA)and PETIA was analyzed. The reference interval was verified.

Results

Testing 29.95 and 132.25 ng/mL patient samples, the within-run coefficients of variation ( CV)were 1.67% and 1.52% ,and the day-to-day CV were 7.17% and 7.84% respectively. The detection low limit and sensitivity were 0.52 and 0.53 ng/mL respectively. The linear correlation coefficient ( r2)was 0.999 4 from 5.4 to 256 ng/mL, and the regression equation was Y=1.014 X +1.063 3. Both of the relative deviations of the high-level serum (5.96%)and low-level serum (8.40%)were lower than the evaluation criteria "target value±20%" of proficiency testing (PT)from National Center for Clinical Laboratories. There was a good correlation between PETIA with SIEMENS electro-chemiluminescence analyzer in 107 patients, YECLIA=1.138 7 XPETIA+2.835 3( r2=0.992 1). There was no obvious interference from hemolysis, jaundice and lipidemia. All the results of 20 healthy subject samples were included in the reference interval recommended by the manufacture.

Conclusions

PETIA is a convenient, rapid, cheap, accurate and reliable method for determining AFP, particularly be suitable for large-scale health screening physical examination.

Keyword: Particle-enhanced turbidimetric immunoassay; Alpha-fetoprotein; Methodology evaluation

甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)是一种胚胎发育早期的高浓度血清糖蛋白, 相对分子质量约为70 000, 由96%的蛋白质和4%的碳水化合物构成。胎儿出生后其浓度逐渐下降, 约1岁时接近成人水平, 但在原发性肝癌和生殖细胞瘤患者中可明显增高, 是早期诊断原发性肝癌的特异性标志物, 亦可用于妊娠时唐氏综合征的筛查及原发性肝癌的预后判断与治疗监测[1]。因此, 准确测定AFP一直受到临床的关注。临床上检测AFP的方法主要有放射免疫法(RIA)、酶免疫法(EIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、荧光免疫法(FIA)、电化学发光法(ECLIA)等, 这些方法各有优缺点[2]。该肿瘤标志物原来无法在全自动生化分析仪上进行快速测定, 近来有公司推出了基于颗粒增强免疫透射比浊法(particle-enhanced turbidimetric immunoassay, PETIA)测定AFP的胶乳试剂, 国内尚未正式引入临床, 亦未见相关文献报道。我们在OLYMPUS全自动生化仪上建立了定量测定AFP的方法, 并对该全新的方法进行方法学评价, 以探讨其临床实用性。

材料和方法
一、检测样本

选取南方医院经临床免疫室化学发光检测的血清样本107例, 其浓度为2.6~252 ng/mL。

二、检测试剂

AFP免疫比浊试剂盒为日本生研(SEIKEN)公司产品(批号630091); AFP定值质控血清为SEIKEN公司产品(批号489122, 大部分蛋白项目溯源至CRM470)。AFP化学发光试剂盒为SIEMENS公司原装进口配套试剂(批号58181132); 干扰物质为Sysmex干扰检查试剂盒(批号ZS1001)。

三、检测仪器

OLYMPUS AU5400全自动生化分析仪, SIEMENS CENTAUR化学发光分析仪。

四、方法
1. 建立AFP比浊测定法

仔细阅读试剂说明书, 编制分析参数:样本量25 μ L, R1 140 μ L, R2 70 μ L, 570 nm单波长, 固定时间法(Fixed), 正反应, 第1测定点13, 第2测定点19。校准类型4AB, 拟合曲线Spline。4点校准:校准品浓度分别为250、100、25、0 ng/mL(中间2个浓度用生理盐水稀释250 ng/mL液态校准品而成), 每浓度校准品重复测定次数为2次。

2. 精密度试验

取高、低不同浓度水平的2份新鲜血清重复测定20次, 计算其均值、标准差和批内变异系数(CV); 另收集2个水平的混合血清, 分装于Eppendorf管中, 贮存于-20 ℃, 复融后恢复至室温, 每天测定1次, 连续测定20 d, 计算天间精密度。

3. 开瓶稳定性试验

高、低水平的质控血清在新开瓶试剂校准后第1天连续测定10次, 将其均值作为基础值, 然后按1、3、5、7……d每天测定1次, 直至连续3次结果超出均值的± 15%的第1次超出天数为开瓶稳定期。

4. 测定下限及测定敏感性

连续10次测定理论值为0的样本(生理盐水), 所得的噪音值(测定平均值)2倍数值为该方法的测定下限, 噪音值的2个标准差为测定敏感性。

5. 线性

将1份256 ng/mL的新鲜血清用生理盐水稀释成256.0、170.6、85.3、42.7、21.4、10.7和5.4 ng/mL 7个浓度梯度, 每份测定2次, 取均值作为实测浓度并对理论浓度做散点图, 计算相关系数和回归方程, 观察方法的线性。

6. 准确性

测定不同水平SEIKEN定值质控血清, 计算其相对偏差, 并与卫生部临床检验中心AFP室间质评能力比对试验(PT)允许总误差进行比较。

7. 干扰

将Sysmex干扰物用纯水复溶至2 mL, 再用纯水稀释成初始浓度的1/10、1/9、1/8、1/7……1/2。取23.0 ng/mL与216.2 ng/mL新鲜血清样本各1份, 将上述干扰物不同梯度的稀释液与原液按1 ∶ 9的比例分别加入样本中, 对照样本中加入同体积的纯水, 2组样本同时进行测试, 计算干扰管的相对偏差。

8. 相关性分析

将107例AFP临床样本在ECLIA检测完毕后收集血清于Eppendorf管中, 置-40 ℃低温冰箱保存, 复融后恢复至室温并混匀, 上机检测, 并将其测定结果与ECLIA结果进行相关性分析, 若显著相关, 计算其回归方程。

9. 参考区间验证

从南方医院健康管理中心体检人群中筛选健康者20名(男、女各10名, 年龄18~63岁), 无患肝胆疾病、妊娠及其他可导致AFP升高疾病, 采集空腹静脉血2 mL, 离心后分离血清用比浊法测定AFP, 测定结果用“ 1/3” 规则进行离群值检验。若出现离群值用新的参考个体代替, 补足20名。观察20名参考个体的观测值在原始报告的参考区间之外是否超过2例。

结果
一、精密度

低浓度新鲜血清重复测定20次的均值和批内CV分别为29.95 ng/mL和1.67%; 高浓度新鲜血清的均值为132.25 ng/mL, CV为1.52%。而其天间CV分别为7.17%和7.84%。

二、开瓶稳定性试验

高、低水平的质控血清初始测定基础值分别为83.7和22.9 ng/mL, 每天测定1次, 其测定值在2周后缓慢下降。直至第29天, 高值质控连续3次结果超出“ 均值± 15%” , 而低值质控在35 d后结果仍未超出“ 均值± 15%” , 可见其开瓶稳定性可达4周。

三、测定下限及测定敏感性

测定生理盐水获得的测定下限为0.52 ng/mL, 测定敏感性为0.53 ng/mL。

四、线性

高值新鲜血清用生理盐水稀释成7个浓度梯度, 实测浓度对理论浓度所做散点图无离群点。相关系数(r2)=0.999 4, 回归方程Y=1.014 4 X+1.063 3。见图1。

图1 PETIA测定AFP的线性回归曲线

五、准确性

高水平定值质控血清靶值89 ng/mL, 测定结果为83.7 ng/mL, 相对偏差5.96%; 低水平定值质控血清靶值25 ng/mL, 测定结果为22.9 ng/mL, 相对偏差8.40%。均低于卫生部临床检验中心AFP PT所要求的“ 靶值± 20%” 的1/2。

六、干扰

血红蛋白浓度≤ 4.8 g/L、甘油三酯(TG)≤ 10.8 mmol/L、胆红素≤ 312.6 mmol/L时对AFP测定影响不明显, 其相对偏差均< 20%, 介于8.7%~15.9%之间, 符合卫生部临床检验中心室间质评对AFP PT的要求。

七、相关性分析

107例AFP临床样本在SIEMENS化学发光分析仪与OLYMPUS全自动生化仪上平行测定, 2种方法测定结果相关性良好(r2=0.992 1), 回归方程为YECLIA=1.138 7XPETIA+2.835 3。见图2。

图2 PETIA与ECLIA测定AFP的相关性

八、参考区间验证

20名健康体检者AFP测定结果介于2.4~8.3 ng/mL之间, 均值为4.1 ng/mL, 中位数为4.7 ng/mL, 全部处于厂家推荐的参考区间内。

讨论

AFP作为一种最经典的肿瘤标志物, 其检测一直受到临床医生的重视和患者的高度关注, 很多单位和个人都将其作为健康检查的一种常规项目, 有肝病史的人群更关心其定量测定的结果。目前在临床上应用较多的检测AFP的方法主要有ELISA、ECLIA 和RIA。ELISA主要用于定性检查, 国产试剂盒已较成熟, 个别进口试剂盒也曾用于AFP定量测定。尽管试剂成本较低, 但由于该方法学的线性范围不够宽、操作繁琐、耗时较长、不同批间检测CV值较大而限制了其在临床定量检测中的应用[3]。RIA敏感性高, 试剂成本也不高, 但由于试剂存在半衰期, 出于环境保护和操作人员个人防护的考虑, 其在临床的应用越来越少, 近年已被ECLIA所取代。而ECLIA因其敏感性高、线性范围宽、自动化程度高、检测快速、精密度好而在临床应用越来越广泛[4, 5], 但该方法需要专用化学发光分析仪和配套的原装试剂, 导致检测成本较高, 收费标准高, 患者检测费用负担较重。因此, 临床亟需一种检测敏感、快速、价廉的AFP定量测定方法。

PETIA是一种全新的AFP定量测定方法, 国内未见报道。其将抗AFP多克隆抗体交联于聚苯丙乙烯颗粒上, 当其在缓冲体系中与样本中AFP发生特异性抗原抗体反应而形成大分子免疫复合物时, 增强了检测的敏感性。本研究结果表明, 这种在全自动生化分析仪上定量测定AFP的方法敏感性可达0.53 ng/mL, 低浓度和高浓度血清批内精密度为1.52%和1.67%, 天间精密度为7.17%和7.84%, 在5.4~256 ng/mL间线性良好, 准确性完全合乎临床要求, 与SIEMENS ECLIA测定结果具有良好的可比性。该法采用临床实验室早已普及的全自动生化仪作为检测仪器, 无需额外添加专用的化学发光仪, 上机检测时10 min即可获得测定结果, 测试速度可大大加快, 每小时可检测数百至数千个样本; 同时, 其试剂成本也比ECLIA大为降低。因此, PETIA测定AFP可作为一种简便易行、快捷价廉、准确可靠的临床常规检测AFP的方法。

生产商提供的参考区间为< 20 ng/mL。参考区间验证结果表明南方医院20名健康体检者的AFP中位数为4.7 ng/mL, 最高值8.3 ng/mL, 全部位于参考区间内, 且相距其上限仍然较远。这20名健康个体的血清AFP值虽然有一部分位于本试验验证的线性5.4~256 ng/mL之间(厂商标明的线性范围下限7 ng/mL), 但有部分低于线性下限。将低于下限的样本经SIEMENS ECLIA测定, 其相对偏差符合美国临床实验室改进修正案88(CLIA'88)对AFP测定允许总误差的要求(≤ 20%)。与ECLIA测定结果的相关性分析表明, PETIA的结果较ECLIA低, 而后者生产商提供的参考区间仅为< 8.1 ng/mL。可见两者有不一致之处, PETIA测定结果偏低, 但其参考上限却远高于ECLIA的参考上限。本试剂说明书未详细说明参考人群的筛选标准、性别构成、年龄组成、地区及人种、数量等基本信息, 难于保证厂商给定的参考区间一定适合本地人群。因此, 引入国内后建立自己的参考区间可能更为合适。

需要注意的是, 很多免疫比浊法试剂盒的测定方式都采用终点法, 采取双试剂尤其是利用胶乳颗粒增强型的试剂一定要扣除样本空白, 并采用多点定标方式拟合测定曲线。但本试剂的测定方式宜采用固定时间法(FIXED), 在加入R2后延迟2个读点(约50 s, 第13点)开始测定起始点吸光度, 反应约2 min后于第19点测定第二吸光度, 测定结果的重复性、准确性、线性俱佳。若采用终点法测定, 结果的重现性和准确性就会受到很大影响, 尤其是低值样本的结果很不稳定, 既使在厂商标称的线性范围内结果的线性也较差。这可能与抗体试剂的效价和亲和力有一定关系, 本反应的斜率不够陡峭, 吸光度的较少变化即可能带来测定的表观浓度变化较大。因此, 设置合理的检测模式和反应参数就显得至关重要。

ECLIA测定AFP的线性范围较宽, 可达1 000 ng/mL[6]; 厂商标明本方法测定AFP的线性范围为7~250 ng/mL, 低于ECLIA。因在全自动生化分析仪上测定, 对于高值临床样本可能出现“ 钩状效应” [7]而导致结果假性偏低, 但通过在特殊参数(special parameters)中设置反应过程监测参数(data check parameters), 可以监测反应过程中是否出现“ 后带现象” , 对浓度过高的样本生化分析仪将会给出报警信息, 从而提醒专业人员将样本预稀释后再进行准确测定。95%以上的临床样本AFP值均低于本法线性范围上限250 ng/mL, 无需样本稀释即可准确定量。随着人们对肿瘤标志物检测的日益重视, AFP作为一种最经典的标志物在临床应用越来越普及, 很多单位将其作为健康普查的项目之一, 而PETIA作为一种低成本、高效率的检测方式应用于临床是完全可行的, 特别适合于健康体检时的大规模筛查。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Chan SL, Chan AT, Yeo W. Role of alpha-fetoprotein in hepatocellular carcinoma: prognostication, treatment monitoring or both[J]. Future Oncol, 2009, 5(6): 889-899. [本文引用:1]
[2] 魏东, 邓爱文, 牟成惠. ICA、RIA和ELISA法测定甲胎蛋白的比较[J]. 第一军医大学学报, 2001, 21(6): 459-460. [本文引用:1]
[3] 陈海蔚, 伍勇. 3种不同方法检测甲胎蛋白的比较[J]. 重庆医科大学学报, 2008, 33(5): 629-630. [本文引用:1]
[4] 高云朝, 赵卫国. 光激化学发光法检测甲胎蛋白实验性能评价[J]. 检验医学, 2009, 24(8): 578-581. [本文引用:1]
[5] 黄妩姣, 黄宪章, 周强, 等. 不同检测系统甲胎蛋白测定结果的可比性研究[J]. 检验医学, 2006, 21(4): 360-363. [本文引用:1]
[6] 王爱英. 实验室两种方法检测血清AFP 结果的比较[J]. 中国误诊学杂志, 2010, 10(6): 1318-1319. [本文引用:1]
[7] 康红, 王兰兰. 免疫比浊法中钩状效应的防范[J]. 国外医学临床生物化学与检验学分册, 2004, 25(6): 551-552. [本文引用:1]