引用本文
苏敏, 寿涛, 孙虹. 类风湿性关节炎患者肿瘤坏死因子α和鞘磷脂酶的检测及临床意义. 2012, 27(11): 890-892
SU Min, SHOU Tao, SUN Hong. Detection of tumor necrosis factor-alpha and sphingomyelinase in patients with rheumatoid arthritis and its clinical significance. Labratory Medicine, 2012, 27(11): 890-892  
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类风湿性关节炎患者肿瘤坏死因子α和鞘磷脂酶的检测及临床意义
苏敏1, 寿涛2, 孙虹1
1. 云南省第一人民医院检验科,云南 昆明 650032
2. 云南省第一人民医院基础研究室,云南 昆明 650032

作者简介:苏敏,女,1974年生,硕士,主管技师,主要从事医学实验诊断学研究。

摘要
目的

探讨鞘磷脂酶(sMase)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)在类风湿性关节炎(RA)患者发生动脉粥样硬化(AS)中的临床意义。

方法

用TNF-α刺激培养的人脐带静脉血管内皮细胞(EC),检测上清液中sMase活性。对124例RA患者[单纯RA组66例、RA合并冠心病(CHD)组58例]和相应对照组检测血清sMase活性、TNF-α浓度水平。

结果

经TNF-α刺激后EC的sMase活性显著升高;RA组患者血清sMase活性高于对照组,尤其是RA合并CHD组;单纯RA组和RA合并CHD组患者血清TNF-α活性高于对照组。

结论

TNF-α刺激EC sMase活性增加。RA患者TNF-α和sMase活性增高与血管内皮损伤有关,sMase有可能成为血管内皮功能障碍(ECD)的实验室诊断指标之一。

关键词: 鞘磷脂酶; 肿瘤坏死因子α; 类风湿性关节炎
中图分类号:446.62 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)11-0890-03
Detection of tumor necrosis factor-alpha and sphingomyelinase in patients with rheumatoid arthritis and its clinical significance
SU Min1, SHOU Tao2, SUN Hong1
1. Department of Clinical Laboratory, the First People's Hospital of Yunnan Province, Yunnan Kunming 650032, China
2. Institute of Clinical and Basic Medicine Research, the First People's Hospital of Yunnan Province, Yunnan Kunming 650032, China
Abstract
Objective

To investigate the clinical significance of sphingomyelinase(sMase)and tumor necrosis factor-alpha (TNF-α)in patients with rheumatoid arthritis (RA)and atherosclerosis (AS).

Methods

The cultured human umbilical cord vein vascular endothelial cells (EC)were stimulated by TNF-α, and the activity of sMase in the supernatant was detected. The serum sMase activity and TNF-α levels were detected in 124 RA patients [66 patients with only RA and 58 RA patients also with coronary heart disease (CHD)] and the corresponding control group.

Results

The sMase activity of EC increased significantly after the stimulation of TNF-α. The serum sMase activity of RA group was higher than that of control group, especially the activity of RA combined CHD group was the highest. The serum TNF-α levels of only RA group and RA combined CHD group were higher than that of control group.

Conclusions

The sMase activity of EC increases with the stimulation of TNF-α. The increases of TNF-α level and sMase activity in RA patients are related to vascular endothelial damage. Therefore, sMase activity may become one of the laboratory diagnostic indicators of vascular endothelial cell dysfunction (ECD).

Keyword: Sphingomyelinase; Tumor necrosis factor-alpha; Rheumatoid arthritis

类风湿性关节炎(RA)是一种慢性自身免疫性疾病, 目前已有充足的临床资料显示RA患者动脉粥样硬化(AS)性心血管事件发生率高于与传统心血管病危险因素相匹配的对照组[1, 2], 绝大部分患者在心血管方面的改变以AS为主。近年来有关AS的研究进展提示, 血管内皮功能损害为其早期改变, 炎症机制参与是其关键因素之一, 其中肿瘤坏死因子α (TNF-α )及其下游信号之一的鞘磷脂酶(sMase)的病理作用受到关注。本研究通过观察TNF-α 刺激血管内皮细胞(EC)后sMase活性的变化, 以及RA患者血清sMase、TNF-α 浓度变化, 初步探讨sMase和TNF-α 在RA患者发生AS中的作用和意义。

材料和方法
一、研究对象
1. RA组

根据美国风湿病协会1987年分类标准, RA组患者124例, 其中单纯RA组为无冠心病(CHD)临床诊断证据的RA患者66例, 男12例, 女54例, 年龄30~58岁; RA合并CHD组RA患者58例, 男12例, 女46例, 年龄43~67岁。CHD诊断参考世界卫生组织缺血性心脏病的命名及诊断标准。

2. 健康对照组

对照1组54名, 与单纯RA组在年龄和性别上匹配; 对照2组50名, 与RA合并CHD组在年龄和性别上匹配。

3. 4组具备共同的条件

(1)无糖尿病史; (2)无高血压; (3)无急性或慢性感染性疾病; (4)无其他风湿免疫病; (5)未连续全身使用激素≥ 3个月, 或持续使用慢作用药物, 或非甾体类抗菌药物≥ 1个月; (6)无肝肾功能异常; (7)年龄> 18岁, 非孕妇或哺乳期妇女; (8)非肿瘤患者; (9)无高胆固醇血症家族史; (10)一级亲属无早发的心血管病(男≤ 45岁, 女≤ 55岁)。

二、主要仪器和试剂

荧光酶标仪(Bio-Tek公司, 美国); 酶标仪(上海科华实验系统有限公司); sMase检测试剂盒(Amplex Red Sphingomyelinase Assay Kit购自Molecular Probes公司, 美国); TNF-α 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒(DIACLONE公司, 法国); M199培养基、胎牛血清(GIBCO公司, 美国); TNF-α 、内皮生长因子、Ⅰ 型胶原酶、胰蛋白酶等(Sigma公司, 美国)。

三、方法
1. TNF-α 刺激EC后sMase活性测定

(1)人脐带静脉EC培养:参见Jaffe等[3]建立的方法。在无菌条件下, 于健康产妇分娩后立即取新生胎儿脐带, 长度> 20 cm, 两端扎紧投入到4 ℃脐带保存液中, 并在4 h内采集细胞。静脉腔内注射0.05 %胶原酶至静脉腔充盈后, 将两端套管用止血钳夹住, 检查无酶液外漏后, 将脐带置于37 ℃水浴。15 min后, 取出脐带, 轻弹几下, 用培养液(不含血清)将酶和细胞悬液冲出, 900× g离心8 min, 去上清液收集沉淀细胞。最后以3× 104个细胞/cm2的密度接种到25 mL培养瓶中, 8~11 d传代培养; (2)TNF-α 刺激EC(培养液中含20 μ g/mL内皮生长因子):选择第2代EC按1× 106个细胞/孔密度接种于24孔板之中的16孔内, 其中8孔加入TNF-α 100 ng/mL, 8孔为阴性对照, 另外8孔只加等量培养液作为空白对照。继续培养1 h后收集上清液, 行sMase检测。

2. sMase活性检测

上清液收集后用Amplex Red Sphingomyelinase Assay Kit和美国Bio-Tek公司荧光酶标仪进行荧光定量检测。采集研究对象清晨空腹血, 离心后收集血清于-70 ℃保存, 由同一技术人员用同一方法进行检测。

3. TNF-α 测定

采集研究对象清晨空腹血, 收集标本后于-70 ℃保存, 由同一技术人员用ELISA试剂盒进行检测。

四、统计学方法

采用SPSS 10.0软件进行统计分析, 组间比较采用单因素方差分析, 两两均数比较用SNK法, P< 0.05表示差异有统计学意义。

结果
一、TNF-α 刺激EC上清液sMase活性检测

经TNF-α 刺激EC后sMase活性显著升高, 与阴性组和空白组比较差异有统计学意义(P< 0.001); 阴性组和空白组之间差异无统计学意义(P> 0.05)。见表1。

表1 TNF-α 刺激EC 后sMase活性与对照组比较
二、各组血清sMase活性和TNF-α 含量测定比较

单纯RA组和RA合并CHD组患者外周血sMase活性均显著高于相应对照组, 尤以RA合并CHD组为显著, 差异有统计学意义(P< 0.05、P< 0.001)。单纯RA组和RA合并CHD组间比较, 差异也有统计学意义(P< 0.001)。单纯RA组和RA.

表2 单纯RA组、RA合并CHD组与对照组血清sMase活性和TNF-α 检测结果
讨论

RA是一种慢性自身免疫性疾病, 主要损害外周关节滑膜, 目前已有充足的临床资料显示RA患者心血管疾病的发病率远高于一般人群, 绝大部分患者在心血管方面的改变以AS为主。近年来的大量研究表明, 感染、炎症和自身免疫的因素促进了AS的形成, 而血管内皮功能障碍(ECD)是其始动因素和关键环节。RA作为一种慢性炎症性疾病, 具备导致ECD的病理基础。

TNF-α 是活动期RA滑膜及血液中重要的细胞因子之一。大量研究发现TNF-α 引起ECD可能是多种途径作用的共同结果, 包括TNF-α 对EC的直接损伤、改变细胞酶类代谢、产生趋化因子、促进EC和成纤维细胞有丝分裂、诱导内皮细胞黏附分子的表达、核转录因子κ B活化、诱导细胞凋亡等。在动脉粥样斑块形成的诸多环节中, TNF-α 和sMase均起着不可忽视的作用。TNF-α 可以刺激EC sMase活性增加, 后者可以水解质膜表面鞘磷脂的磷酸二酯键, 产生神经酰胺和磷酸胆碱。神经酰胺作为一种重要的第二信使, 可在多种信号传导过程中发挥作用, 参与多种细胞功能。神经酰胺通过增加活性氧导致内皮细胞一氧化氮生物活性下降, 干扰血管内皮舒张功能[4, 5]。C6-神经酰胺、C8-神经酰胺、C16-神经酰胺, 尤其是C16-神经酰胺可引起很强的血管收缩作用, 局部出现细胞黏附和出血[6]。此外, TNF-α 广泛存在于人的AS斑块中, AS患者的内皮功能紊乱与其作用有关, 作为惟一能分泌到细胞外的sMase, 分泌型sMase出现在AS病灶中并与胞外基质相结合。其能增加巨噬细胞对低密度脂蛋白(LDL)的摄取、降解和胆固醇酯化, 促进泡沫细胞形成[7], sMase在AS的发生、发展中的作用不容忽视。本研究结果显示, 培养的EC给予TNF-α 刺激后, sMase活性显著上升。在单纯RA组患者和RA合并CHD的患者中观察到TNF-α 增高, 同时也观察到sMase活性增加, 尤其是RA合并CHD组患者的血清sMase活性显著高于单纯RA组和对照组。由于TNF-α 与ECD相关, sMase活性增高间接提示ECD的存在, 其有可能成为ECD的实验室诊断指标之一。

在RA患者中TNF-α 除可以通过sMase引起ECD外, 还能干扰患者的脂质代谢。一方面, 其增加肝脏脂肪酸和胆固醇合成, 促进脂肪组织的脂肪分解, 增加血液中的总胆固醇和LDL; 另一方面, TNF-α 上调内皮脂肪酶的表达, 并刺激其活性, 加速高密度脂蛋白(HDL)的分解。Popa等[8]研究发现, RA患者经过2周的抗TNF-α 治疗后HDL水平明显上升, LDL和甘油三酯无明显变化。因此, 在RA的治疗中TNF-α 拮抗剂的使用已成为一种新的选择。

由于AS的发生与RA有着许多共同的炎症基础, RA患者可能存在发生AS的多重危险因素。本研究仅对TNF-α -sMase途径进行初步探讨, 更多RA患者血管内皮损伤导致AS发病机制的研究还有待于深入和拓展。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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