引用本文
鲁艳军, 田俊, 狄勇, 宗义强. 运用双向荧光差异凝胶电泳分析VLDL致THP-1来源泡沫细胞的形成. 2012, 27(1): 50-56
LU Yanjun, TIAN Jun, DI Yong, ZONG Yiqiang. Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis analysis for VLDL-induced THP-1 foam cell formation. Labratory Medicine, 2012, 27(1): 50-56  
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运用双向荧光差异凝胶电泳分析VLDL致THP-1来源泡沫细胞的形成
鲁艳军1, 田俊2, 狄勇2, 宗义强2
1. 华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科,湖北 武汉 430030
2. 华中科技大学同济医学院生物化学与分子生物学系, 湖北 武汉 430030

作者简介：鲁艳军,男,1981年生,博士,住院医师,主要从事动脉粥样硬化的蛋白组学研究。

摘要
目的

运用双向荧光差异凝胶电泳结合质谱技术寻找极低密度脂蛋白(VLDL)致诱导分化的THP-1细胞形成泡沫细胞中的关键蛋白质,以期揭示其致泡沫细胞的机制。

方法

THP-1细胞经佛波醇脂(PMA)诱导分化为巨噬细胞,以磷酸盐缓冲液(PBS)孵育为空白对照组、VLDL孵育为实验组。提取细胞总蛋白后分别用荧光染料CY3和CY5标记,以所有样本等量混合作为“内标”,用CY2标记,然后将实验组、空白对照组及内标混合后进行二维电泳,扫描图像后经分析的差异蛋白做基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)。采用逆转录-聚合酶链反应(RT-CPR)分析3种蛋白质(脂肪分化相关蛋白、烯醇化酶1、磷酸甘油酸变位酶1)mRNA的变化。

结果

实验组与空白对照组比较,表达量上调蛋白点在1.2倍以上有34个,表达量下调1.2倍以上有48个。通过软件筛选其中14个有差异的蛋白点做MALDI-TOF-MS,其中脂肪分化相关蛋白、热休克蛋白27、人电子转移味蛋白三维结构-链A、s100钙结合蛋白、人过氧化物酶-3-异构体c、辅酶-细胞色素C还原酶核心蛋白I、过氧化物酶烯酰辅酶A水合酶样蛋白、富马酸合酶-异构体d表达增高,烯醇化酶1、磷酸甘油酸变位酶1、环孢素A结合双肽甘氨酸-脯氨酸复合物、DMGDH 蛋白、核内不均一核糖核蛋白L-异构体a、果糖胺3激酶-异构体b表达降低。脂肪分化相关蛋白mRNA表达明显上调,烯醇化酶1、磷酸甘油酸变位酶1 mRNA表达明显下调,与蛋白水平变化一致。

结论

荧光差异凝胶电泳能在整体上揭示VLDL在致泡沫细胞形成过程中蛋白质水平的变化,经鉴定的蛋白质可能在VLDL致泡沫细胞的形成中发挥重要的作用,为阐明VLDL作用巨噬细胞形成泡沫细胞的机制奠定了基础。

关键词: 极低密度脂蛋白; 双向荧光差异凝胶电泳; 泡沫细胞; 蛋白质组
中图分类号:Q513 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)01-50-07
Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis analysis for VLDL-induced THP-1 foam cell formation
LU Yanjun1, TIAN Jun2, DI Yong2, ZONG Yiqiang2
1. Department of Clinical Laboratory, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Hubei Wuhan 430030, China
2. Department of Biochemistry and Molecular Biology, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Hubei Wuhan 430030, China
Abstract
Objective

To search for the key protein in the process of THP-1 foam cell formation induced by very low density lipoprotein (VLDL) through using two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (DIGE) analysis and analyze the mechanism of foam cell.

Methods

The macrophage differentiation from THP-1 cells induced by phorbol ester (PMA), incubated with phosphate buffer(PBS)as control group and incubated with VLDL as experimental group, respectively. After the extraction of total cellular protein labeled with fluorescent dye CY3 and CY5, the mixture of all samples were equalled as an "internal standard", labeled with CY2 . The mixture of experimental group, control group and the internal standard was analyzed by DIGE and matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). The 3 protein (adipose differentiation-related protein,enolase 1 and phosphoglycerate mutase 1) mRNA changes were analyzed with reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR).

Results

Compared the experimental group with control group, there were 34 protein spots up regulated >1.2 times, and 48 protein spots down regulated >1.2 times. A total of 14 protein spots defined as "significant spots" were identified by MALDI-TOF-MS. The expressions of adipose differentiation-related protein,heat shock 27kDa protein 1, three-dimensional structure of human electron transfer flavoprotein to 2.1 A resolution-Chain A, S100 calcium binding protein A11, peroxiredoxin 3-isoform CRA_c, ubiquinol-cytochrome c reductase core protein I, peroxisomal enoyl-coenzyme A hydratase-like protein and fumarate hydratase-isoform CRA_d were increased. The expressions of enolase 1,phosphoglycerate mutase 1,cyclophilin A complexed with dipeptide Gly-Pro,DMGDH protein, heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L-isoform CRA_a and fructosamine 3 kinase-isoform CRA_b were decreased. The mRNA expression of adipose differentiation-related protein was increased, and the mRNA expressions of enolase 1 and phosphoglycerate mutase 1 were decreased obviously with the levels of proteins.

Conclusions

DIGE has revealed a whole change in the process of VLDL-induced foam cell formation,and the protein identified may play an important role in the process, which as the ground work for clarifying the mechanism of VLDL-induced foam cell formation.

Keyword: Very low density lipoprotein; Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis; Foam cell; Proteomics
引言

有研究[ 1]表明,在高甘油三酯(TG)血症的人群中,动脉粥样硬化的发生与血浆中增高的极低密度脂蛋白(VLDL)及VLDL来源的残余脂质颗粒成正相关。VLDL能够进入血管内皮下导致细胞内脂质的堆积[ 2],体外实验也表明VLDL能诱导泡沫细胞形成[ 3]。然而,富含TG的VLDL与富含胆固醇的低密度脂蛋白(LDL)在致泡沫细胞形成乃至动脉粥样硬化的机制不尽相同。LDL经修饰后主要通过CD36介导的胞吞作用而引起脂质堆积,而富含TG的VLDL导致胞内脂质的堆积有2种方式。一种是与细胞表面的脂肪酶(LPL)作用,经LPL的脂解,生成的游离脂肪酸直接进入胞内酯化为TG储存起来。另一种方式是经过极低密度脂蛋白受体(VLDLR)介导的胞吞作用[ 4]。2种脂蛋白进入细胞后激活不同的核受体而影响胞内脂质堆积,氧化的LDL主要通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)而调节ATP结合盒转运子A1(ABCA1)及清道夫受体(SR)等来改变脂质对细胞的堆积,而VLDL 主要激活氧化物酶体增殖物激活受体δ(PPAR-δ), 上调肉碱脂酰转移酶-1(CPT-1),而影响胞内脂质堆积[ 5]。目前关于富含胆固醇的脂蛋白LDL、氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)作用的巨噬细胞形成泡沫细胞机制比较深入,但由富含TG的脂蛋白VLDL作用而形成泡沫细胞的机制还鲜见报道。

我们拟通过双向荧光差异凝胶电泳(2D-DIGE)得到VLDL孵育的经佛波醇酯(PMA)诱导的THP-1细胞与经磷酸盐缓冲液(PBS)孵育的空白对照细胞的蛋白质图谱,并用相应的软件分析其差异,以探讨VLDL致泡沫细胞形成过程中特定蛋白表达量发生的变化。初步观察VLDL在致泡沫细胞过程中某些关键蛋白表达的改变,以探讨对泡沫细胞形成的作用影响。

材料和方法
一、VLDL的制备

取100 mL人新鲜血浆,18 000× g离心40 min去除乳糜微粒,然后按每毫升血浆加0.226 g 溴化钠(NaBr)调整血浆密度至1.2 g/mL。于离心管中依次加入密度为1.006 g/mL 的氯化钠(NaCl)、1.063 g/mL的NaBr和1.2 g/mL的血浆。采用L8-80型超速低温离心机(美国贝克曼公司)以300 000× g超速离心5 h。取离心管中顶层VLDL液体(密度<1.006 g/mL),经PBS透析后于4 ℃避光保存,保存不超过2周。

二、细胞培养

THP-1细胞[购自美国模式培养物集存库(ATCC)]用含10%胎牛血清的1640培养基在37℃、5%CO2的环境中培养,待细胞密度达1×106/mL,加入200 nmol/L PMA诱导24 h后更换不含血清的1640培养基培养24 h,然后加入50 μg/mL VLDL孵育48 h。

三、细胞总蛋白的提取

将孵育后的细胞经PBS洗涤去除培养基,然后用细胞刮刮下细胞,加200 μL细胞裂解液[30 mmol/L TrisC、7 mol/L尿素,2 mol/L硫脲、4% 3-(3-胆胺丙基)二甲氨基-1-丙磺酸(CHAPS),pH值8.5] 冰浴30 min,期间不停震荡。然后用超声细胞破碎仪冰浴中每次超声10 s,共5次。以5 000× g离心70 min,收集上清后用2-DQuantKit试剂盒进行蛋白定量。

四、荧光染料标记

制备的样本经精确定量后按50 μg蛋白样本/400 pmol荧光染料(Cy3或Cy5)(购自美国通用电气医疗集团)冰上避光反应30 min,然后加入10 mmol/L 赖氨酸1 μL终止反应。将Cy3标记的样本、Cy5标记的样本以及Cy2标记的内标混合后,加等体积2×sample buffer[7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲,20 mg/mL二硫苏糖醇(DTT)、4%CHAPS]混匀,冰上静置10 min,用水化液(8 mol/L尿素、4%CHAPS,0.5% IPG3-10 buffer、10 mg/mL DTT)补至350 μL,准备双向电泳。

五、双向电泳及图象扫描

将含有样本的水化液均匀涂布在胶条槽两电极之间,将IPG干胶条(pH值310,18 cm)胶面向下,覆盖一层IPG strip cover fluid,盖上胶条槽盖,设置等点聚焦电泳(IEF)程序为:30 V 12 h、200 V 1 h、500 V 1 h、1 000 V 1 h、8 000 V 50 000 vhs。IEF结束后的胶条放在10 mL含1% DTT的十二烷基磺酸钠(SDS)平衡液中平衡15 min,然后放在10 mL含4%碘代乙酰胺的平衡液中平衡15 min,平衡后置于胶浓度为12.5%的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)胶中,放入Ettan DALT six垂直电泳系统中电泳,电泳参数为2 W/胶、1 h进胶、15W/胶,直至溴芬蓝跑至胶底缘。电泳结束后置Typhoon9410多功能扫描成像系统上扫描,扫描参数为Cy2 emission filter/laser, 波长比为520/488 nm、Cy3为580/532 nm、Cy5为670/633 nm。扫描后获取图像。所使用仪器及试剂均购自美国通用电气医疗集团。

六、二维电泳胶染色、结果分析

电泳结束后,将制备胶放在含0.1% R-350、10%冰乙酸、10%甲醇的染色液过夜,用含10%冰乙酸、10%甲醇的脱色液脱色,直至背景干净。将胶放在Imagescaner扫描仪(美国通用电气医疗集团)上扫描,扫描参数为 300 dpi、blankfilter、transmissive。

七、质谱鉴定

在制备胶上挖取差异蛋白点经胶内胰酶酶解20 h,然后抽提酶解肽段,经微量层析柱(ZipTip)脱盐、基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)/MALDI-TOF/TOF质谱(MALDI-TOF-MS)和软件分析数据鉴定蛋白质。

八、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分析

孵育后的细胞经PBS洗涤去除培养基后,通过Trizol提取液提取总RNA,定量后取8 μg RNA 作逆转录合成cDNA,进行PCR。脂肪分化相关蛋白上游引物:5'-AGGGGCTAGACAGGATTGAGGA-3',下游引物:5'-TTTTCTACGCCACTGCTCACG-3';烯醇化酶上游引物:5'-CGCATTGGAGCAGAGG TTTAC-3',下游引物:5'-GCAGTTGCAGGACTTC TCGTT-3';磷酸甘油酸变位酶1上游引物:5'-GAGCCCGACCATCCTTTCTACA-3',下游引物:CAGTCGGCAGGTTCAGC-3'。β-actin上游引物:5'-TGAGACCTTCAACACCCCAG-3',下游引物:5'-GCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3'。扩增条件如下:95 ℃ 5 min, 95 ℃ 45 s, 55 ℃ 45 s,72 ℃ 45 s,共30个循环。PCR产物经含溴化乙锭的2%琼脂糖胶电泳,并在紫外灯下成像。试剂购自美国伯乐生命医学产品有限公司。

结果
一、 油红染色观察泡沫细胞的形成

为了观察VLDL孵育THP-1源性巨噬细胞后是否形成泡沫细胞,通过油红O染色比较VLDL孵育的细胞(实验组)和PBS孵育的细胞(空白对照组)。THP-1源性巨噬细胞经PMA诱导24 h 后加脂蛋白孵育48 h,用0.3%油 红O染色,光镜下观察。结果显示相对于空白对照组,实验组孵育的细胞胞内脂质明显增多。见 图1。

图1 经PBS、VLDL孵育的细胞内脂质情况注:(a)空白对照组;(b)实验组

二、2D-DIGE的图谱

孵育后的细胞提取细胞总蛋白,按50 μg蛋白样本/400 pmol荧光染料(Cy3或Cy5)标记,所有样本混合用Cy2标记,将不同染料标记的样本混合后于同一胶上做二维电泳,电泳结束后,置Typhoon9410多功能扫描成像系统上扫描捕获图像。 图2中的4幅图是一块胶扫描所得,每块胶有3种样本,分别为空白对照、实验组及内标,每种样本为50 μg,由3种不同的荧光染料标记,内标始终为Cy2标记。

图2 2D-DIGE图谱注:(a)Cy3标记的空白对照组,即为未加VLDL刺激的经PMA诱导的THP-1细胞样本;(b)Cy5标记的实验组,即为加VLDL刺激的经PMA诱导的THP-1细胞样本;(c)Cy2标记的内标,即为所有样本等量混合;(d)前3幅图的重叠图

三、MALDI-TOF-MS 鉴定差异蛋白

每张胶上平均有2 400个蛋白点。实验组与空白对照组比较,表达量上调蛋白点在1.2倍以上有34个,表达量下调1.2倍以上有48个。通过软件分析筛选其中14个蛋白点作MALDI-TOF-MS。见 图3、 表1。

图3 考马司亮蓝染色的制备胶二维图像注:图上箭头标记的点为经过软件分析有差异的蛋白点

表1 筛选出的14个蛋白点经MALDI-TOF-MS分析的结果
四、RT-PCR分析部分鉴定蛋白mRNA水平的变化

为证实上述鉴定的蛋白变化,选取脂肪分化相关蛋白、烯醇化酶、磷酸甘油酸变位酶1 共3种蛋白质依据Genebank 提供的mRNA序列设计引物,提取实验组及空白对照组RNA进行RT-PCR,分析其mRNA 的变化。见 图4。脂肪分化相关蛋白mRNA在泡沫细胞中表达明显上调,与蛋白水平变化一致。 烯醇化酶、磷酸甘油酸变位酶1 mRNA在泡沫细胞中表达明显下调,与蛋白水平变化相一致。

图4 RT-PCR分析3种鉴定蛋白mRNA水平的变化

讨论

目前已有大量实验表明富含TG的VLDL在动脉粥样硬化形成中发挥作用。VLDL可以引起巨噬细胞脂质堆积形成泡沫细胞,而泡沫细胞形成已被视为动脉粥样硬化形成早期的重要事件。与LDL相比,VLDL中的载脂蛋白主要是载脂蛋白E(apo E),主要脂质成分是TG。因而VLDL在致泡沫细胞的形成过程是否存在独特的机制?目前鲜有报道。2D-DIGE是二维电泳(2-DE)的新方法,其灵敏度更高(pg)、所需上样量更少(50 μg)、得到的结果更稳定可靠(线性范围在5个数量级)。由于将不同样本在同一胶上分离,所需胶的数量更少,重复性更好。本研究运用2D-DIGE结合质谱技术,发现数种可能在VLDL致泡沫细胞形成中的发挥较重要作用的相关蛋白,如脂肪分化相关蛋白、糖酵解磷酸甘油酸变位酶1、烯醇化酶等。

脂肪分化相关蛋白早期被发现参与脂肪细胞的分化,近来发现其与细胞内脂滴的形成密切相关。脂肪分化相关蛋白的过量表达可以增加长链脂肪酸的吸收[ 6]。有研究显示脂肪分化相关蛋白在动脉粥样硬化斑块中的表达比同一血管正常部位高,脂肪分化相关蛋白的高表达可能是引起巨噬细胞脂质堆积的重要因素[ 7]。另有报道[ 8]显示这种蛋白的升高可以抑制TG经线粒体氧化途径而促进脂质在细胞内的沉积,因而其升高与TG代谢密切相关。而VLDL可以通过激活PPAR-δ来上调其表达,且这种上调发生在转录水平[ 5]。

参与糖酵解的磷酸甘油酸变位酶1和烯醇化酶被鉴定在VLDL致泡沫细胞的过程中下调。磷酸甘油酸变位酶催化3-磷酸甘油酸转变为2-磷酸甘油酸,烯醇化酶催化2-磷酸甘油酸转变为磷酸烯醇式丙酮酸。虽然并未发现糖酵解的关键激酶,但这些酶的表达下调从机体代谢角度提示胞内糖的利用减少。Sukhano等[ 9]的研究显示在氧化LDL孵育的人主动脉平滑肌细胞内糖利用率减少65%,且这2种酶在高脂喂食的鼠的白色脂肪组织中表达下调[ 10]。可见胞内糖的利用与脂质含量密切相关,而已知细胞内游离脂肪酸通过线粒体代谢的中间产物抑制糖酵解。因而这2种酶的改变可能通过影响糖代谢而促进脂质负荷的细胞泡沫化。

辅酶-细胞色素C还原酶核心蛋白I 和人电子转移味蛋白三维结构-链A这2种蛋白属于线粒体电子传递链的一部分,其上调反映细胞线粒体能量代谢活跃。然而线粒体是超氧阴离子产生的重要场所,而活性氧的增加及随后产生的氧化应激已被视为动脉粥样硬化的危险因素[ 11]。另本研究发现位于线粒体膜上的人过氧化物酶-3-异构体c也表达上调。人过氧化物酶-3-异构体c的主要功能是阻止线粒体活性氧的产生。因而推测VLDL致泡沫细胞形成过程中胞内由线粒体生成的活性氧增多,且主要由于VLDL中大量TG所致。而Aroni等[ 12]已经报道经TG处理过的J774.2巨噬细胞其胞内活性氧显著升高,且主要通过线粒体复合物1的电子转移链,这进一步支持本研究的推测。

VLDL致泡沫细胞中筛选的蛋白质多与脂肪酸代谢相关,而文献[ 13]报道ox-LDL致泡沫细胞中信号分子丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)、电压依赖性阴离子通道1(VDAC1)及抗氧化酶(过氧化氢酶、前列腺素氧化环化酶)表达改变。另本研究仅筛选出热休克蛋白27的表达上调,而Yu等[ 14]通过二维电泳发现ox-LDL孵育的巨噬细胞U937中多种热休克蛋白(热休克蛋白27、60、70)表达上调。推测上述差异是由2种脂蛋白的组成不同而引起胞内信号途径变化所致。本研究鉴定与TG代谢密切相关的蛋白,进一步将从动脉粥样斑块组织验证是否也有类似变化,以期为动脉粥样硬化形成提供新的可能标志物。

The authors have declared that no competing interests exist.

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