引用本文
陈曲波, 黄妩姣, 黎翠翠, 蒋莉, 丁海明, 肖倩, 黄素丹. Array-ELISA法和ECLIA法测定六项肿瘤标志物的比较研究. 2012, 27(1): 4-7
CHEN Qubo, HUANG Wujiao, LI Cuicui, JIANG Li, DING Haiming, XIAO Qian, HUANG Sudan. Comparison research of Array-ELISA and ECLIA in determination of six tumor markers in serum. Labratory Medicine, 2012, 27(1): 4-7  
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Array-ELISA法和ECLIA法测定六项肿瘤标志物的比较研究
陈曲波, 黄妩姣, 黎翠翠, 蒋莉, 丁海明, 肖倩, 黄素丹
广东省中医院检验医学部,广东 广州 510120

作者简介：陈曲波,男,1964年生,硕士,主任技师,主要从事自身免疫及肿瘤免疫研究。

基金:广东省科技厅社会发展计划资助项目（2008B060642）;
摘要
目的

分析和评价6项肿瘤标志物测定试剂盒[微阵列酶联免疫法(Array-ELISA)]在肿瘤标志物检测中的应用价值。

方法

采用Array-ELISA和电化学发光免疫分析法(ECLIA)检测相同标本的6项临床常见肿瘤标志物:甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)、糖类抗原125(CA125)、糖类抗原199(CA199)和糖类抗原153(CA153)。采用受试者工作特征(ROC)曲线进行分析。

结果

2种方法检测AFP、CEA、PSA 和CA125的阳性率差异无统计学意义(P>0.05),检测CA199和CA153的阳性率差异有统计学意义(P<0.01)。2种方法对AFP、CEA、PSA、CA125和CA199的检测结果总符合率均>85%,仅CA153的总符合率为61.1%。2种方法对6项肿瘤标志物的检测结果显著相关(P<0.01),相关系数(r)为0.6950.960。2种方法检测AFP、CEA、PSA、CA125和CA199对相关肿瘤诊断的ROC曲线下面积介于0.620.99之间;用Array-ELISA检测CA153对乳腺癌诊断的ROC曲线下面积低于ECLIA。

结论

Array-ELISA与ECLIA对6项肿瘤标志物的检测结果均有良好一致性,可以引入Array-ELISA检测6项肿瘤标志物作为常规体检项目和筛查项目。

关键词: 微阵列酶联免疫法; 电化学发光法; 方法学比较; 肿瘤标志物
中图分类号:R446.61 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)01-4-04
Comparison research of Array-ELISA and ECLIA in determination of six tumor markers in serum
CHEN Qubo, HUANG Wujiao, LI Cuicui, JIANG Li, DING Haiming, XIAO Qian, HUANG Sudan
Department of Clinical Laboratory, Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine, Guangdong Guangzhou 510120,China
Abstract
Objective

To analyze and evaluate the clinical application of tumor marker detection kit [microarray enzyme-linked immunosorbent assay(Array-ELISA)] in determining 6 tumor markers.

Methods

Electro-chemiluminescence immunoassay(ECLIA) analyzer was used to detect 6 clinically common tumor markers: alpha fetoprotein (AFP), carcinoembryonic antigen (CEA), prostate specific antigen(PSA), carbohydrate antigen 125(CA125), carbohydrate antigen 199(CA199) and carbohydrate antigen 153(CA153). The receiver operating characteristic(ROC)curve was evaluated.

Results

There were no significant differences in the positive rates of AFP, CEA, PSA and CA125 by the 2 methods(P>0.05),while the positive rates of CA199 and CA153 had statistical significance (P<0.01). The determination results of AFP, CEA, PSA, CA125 and CA199 by the 2 methods showed high total coincidence rate (>85%),and the total coincidence rate of CA153 was 61.1%. The correlation was significant [P<0.01, correlation coefficient (r)=0.695-0.960], and areas under ROC curves of AFP, CEA, PSA, CA125 and CA199 were 0.62-0.99. The area under ROC curve of CA153 by Array-ELISA was lower than that of ECLIA in the diagnosis of breast carcinoma.

Conclusions

Both Array-ELISA and ECLIA show good coincidence in detecting the 6 tumor markers, and Array-ELISA could be introduced for clinical routine examination and screening testing of determining 6 tumor markers.

Keyword: Microarray enzyme-linked immunosorbent assay; Electro-chemiluminescence immunoassay; Methodology comparison; Tumor marker
引言

微阵列酶联免疫法(Array-ELISA)是近年来在生命科学领域中迅速发展起来的高新科技。Array-ELISA技术平台主要包含3项技术:酶促化学发光技术、现代微阵列技术以及低温电荷耦合器(CCD)成像技术。其原理是在保证相互无干扰的前提下,多种特异性的生物活性物质(如肿瘤标志物抗体)以特定的微阵列形式排列于每个微孔板板孔内,待血清或血浆中抗体/抗原与包被抗原/抗体特异性结合后,再与酶标抗体结合形成免疫复合物,加入发光液,经生物芯片阅读仪分析处理,可同时获得多项指标定量检测结果[ 1]。我们分别应用Array-ELISA 和电化学发光免疫分析法(ECLIA)对6项肿瘤标志物[甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)、糖类抗原125(CA125)、糖类抗原199(CA199)和糖类抗原153(CA153)]进行了检测,分析和评价Array-ELISA在肿瘤检测中的应用价值。

材料和方法
一、材料

1. 研究对象 2010年1月至8月就诊于广东省中医院门诊及住院部的患者共208例,其中男114例、女94例,年龄2089岁。所有病例都经临床确诊,部分病例经组织病理学确诊。

2. 标本收集 所有研究对象均清晨空腹采静脉血3 mL, 静置20 min后,室温1 800× g离心5 min,分离血清,用ECLIA检测肿瘤标志物后,保留和收集血清,再用Array-ELISA检测6项肿瘤标志物。

3. 仪器与试剂 6项肿瘤标志物测定试剂盒(Array-ELISA)由北京华大吉比爱生物技术有限公司研制生产。Roche Cobas 601电化学发光分析仪由罗氏公司生产并提供原装配套试剂、校准品和质控物。

二、方法

1. 6项肿瘤标志物测定试剂盒(Array-ELISA)原理 试剂盒工作原理为双抗体夹心法。AFP、CEA、PSA、CA125、CA199和CA153特异性抗体组合以微阵列的形式排布在微孔板内,板孔中加入标准品或待测血清/血浆标本,反应后洗涤,再加入酶标抗体工作液继续温育反应,反应结束后洗涤,最后加入发光液,发光信号随待测标志物浓度的增加而增强。用生物芯片阅读仪精确地对微孔板内微阵列信号进行采集和图像处理,配合数据分析软件,获得待测标本中6项肿瘤标志物的定量检测数据及结果。

2. Array-ELISA操作步骤 在微孔板中按顺序依次加入6项肿瘤标志物的标准品、质控品以及待测标本各50 μL;温育第1次;用封口膜封口,37 ℃振荡反应45 min;洗液洗板5次,拍干; 然后加入酶标抗体工作液50 μL;温育第2次;再洗板5次,拍干;最后每孔加入40 μL 发光液A和发光液B的混合物,立即放入生物芯片阅读仪检测。

3. Roche Cobas 601电化学发光免疫分析仪检测 按照仪器操作说明书对6项肿瘤标志物进行检测分析。

4. 结果判断 ECLIA的参考范围(根据试剂盒说明书):AFP<8.1 ng/mL,CEA<5 ng/mL,PSA<4 ng/mL,CA125<35 U/mL,CA199<27 U/mL,CA153<25 U/mL,超出以上范围判定为阳性。Array-ELISA的参考范围(根据试剂盒说明书):AFP<20 ng/mL,CEA<5 ng/mL,PSA<4 ng/mL,CA125<35 U/mL,CA199<37 U/mL,CA153<28 U/mL,超出以上范围判定为阳性。

三、统计学方法

使用SPSS 18.0统计软件进行数据处理,率的比较采用 χ2检验; 2种方法定量结果的相关性比较用Spearman秩相关检验;2种检测方法对6项肿瘤标志物相关肿瘤临床诊断效能的比较采用受试者工作特征(ROC)曲线分析,通过判断点(Cut-off值)的移动,获得多对敏感性和误判率(1-特异性),以敏感性为纵坐标,以(1-特异性)为横坐标,连接各点绘制曲线,然后计算曲线下的面积,面积越大,判断价值越高。检验水平 α=0.05。

结果
一、Array-ELISA和ECLIA对肿瘤标志物的阳性检出率分析

根据2种方法各自的参考范围统计其阳性率。2种方法对AFP、CEA、PSA 和CA125的阳性检出率差异无统计学意义( P>0.05),但对CA199和CA153的阳性检出率差异有统计学意义( P<0.01),见 表1。

表1 Array-ELISA和ECLIA对肿瘤标志物的阳性检出率
二、Array-ELISA和ECLIA对肿瘤标志物的检测结果分析

以ECLIA为标准,将研究对象分为阳性组和阴性组,计算Array-ELISA的相对敏感性、相对特异性和总符合率。2种方法对AFP、CEA、PSA、CA125和CA199的检测结果的总符合率均在85%以上,CA153的总符合率最低(61.1%)。两者的Spearman秩相关检验结果显示,Array-ELISA与ECLIA检测结果具有正相关关系( r=0.6950.960, P<0.01),其中CA125测定结果的 r值最高,为0.960,见 表2。

表2 Array-ELISA和ECLIA对肿瘤标志物的检测结果比较
三、Array-ELISA和ECLIA检测肿瘤标志物对相关肿瘤的诊断准确性能分析

应用ROC曲线分析2种方法对6项肿瘤标志物诊断肿瘤的价值。结果提示2种方法检测分别对AFP、CEA、PSA、CA125和CA199与相关肿瘤诊断的ROC曲线下面积具有较好的一致性,CA153用Array-ELISA检测的ROC曲线下面积低于ECLIA,见 表3。

表3 Array-ELISA和ECLIA检测6项肿瘤标志物对相关肿瘤的诊断效能比较
讨论

肿瘤标志物的检测对肿瘤辅助诊断及判断肿瘤预后、转归、疗效评价都具有重要的临床意义,并已成为临床检测的重要项目之一。由于单个肿瘤标志物的敏感性和特异性有限,在进行肿瘤标志物检测时,国际上普遍采用多指标联合检测的方式,以提高阳性检出率,避免漏检[ 2]。肿瘤标志物的检测方法历经发展和应用,主要有放射免疫分析、酶免疫分析、化学发光免疫分析、时间分辨荧光免疫分析、ECLIA、生物芯片技术等[ 3]。基于一些传统的检测方法仍具有某些优点,因而在相当长一段时间内, 各种检测肿瘤标志物的方法可以互补共存,同时发展。

迄今为止,发现的肿瘤标志物已经超过100种,选择正确的肿瘤标志物组合成为必要。美国临床生化学会、美国癌症学会和美国内科医师学会的研究调查结果显示,6项肿瘤标志物AFP、CEA、PSA、CA125、CA199、CA153是目前临床评价最稳定、诊断意义最明确、公认程度最高的典型标志物,几乎能覆盖所有常见肿瘤,对辅助诊断、疗效观察等具有重要的指导意义[ 4]。6项肿瘤标志物测定试剂盒(Array-ELISA)将6项指标平行检测,一次性出结果,相对减少了各单项指标的检测成本,实际检测时间也大幅度缩短。

本研究用Array-ELISA和ECLIA检测6项肿瘤标志物,虽然 表1显示2种方法对CA199和CA153的检出阳性率差异有统计学意义( P<0.01),但2种方法对AFP、CEA、PSA、CA125和CA199的总符合率都在85%以上,Spearman秩相关检验结果也显示Array-ELISA与ECLIA的检测结果呈明显正相关( P<0.01),其中CA125测定结果的 r值最高,与相关文献报道一致[ 5]。ROC曲线下面积可全面、直观、准确地反映检测方法的诊断性能, 曲线下面积越大诊断效率越高。本研究结果显示,2种方法检测6项肿瘤标志物(CA153除外)对相关肿瘤的诊断性能比较接近。 所以,在6项肿瘤标志物(特别是AFP、CEA、PSA、CA125和CA199)的所测结果中,Array-ELISA和ECLIA具有较高的一致性。但从比较中也可看出,Array-ELISA和ECLIA对CA153检测结果的一致性稍差,2种方法无论是阳性检出率、总符合率、 r值还是诊断性能比较,CA153的结果都是最低。由于ECLIA是目前敏感性较高的检测方法之一,本研究结果进一步证明了Array-ELISA测定CA153敏感性不够,可能造成一些低滴度的CA153阳性的漏检。另外,不同的抗原抗体反应的最佳条件(如温度、酸碱度、孵育时间)是不一样的,如何将不同的抗原抗体反应统一到一个条件下进行,并产生最佳结果,这是保证Array-ELISA的关键所在,也是难点所在。所以当标本的检测结果不一致时,还需要进一步研究,包括各检测系统的改进、完善、可溯源性、影响因素的剔除、患者的长期随访等[ 6]。

综上所述,Array-ELISA与ECLIA对6项肿瘤标志物测定结果的一致性良好,可基本满足临床要求。随着生活水平的提高,人民对疾病的防范、管控意识也在不断的增加。人们越来越认可定期的体检能减少患病风险,减少治疗成本。ECLIA的进口试剂由于其成本太高(尤其是糖蛋白系列),仅局限于临床可疑标本的检测,不适合健康人群大批量体检检测,而Array-ELISA肿瘤标志物测定系统不仅可以提高工作效率,还可降低检测费用,在大规模人群体检方面优势尤为明显,所以临床可以引入Array-ELISA检测6项肿瘤标志物作为常规体检项目,以更好保障人民健康。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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