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朱召芹, 范齐文, 胡香南, 刘芳, 郭建, 宰淑蓓, 杨华, 宋志刚, 吴文娟. 结核分枝杆菌动物建模试验中ABSL-3实验室内生物安全评估. 2012, 27(1): 34-38
ZHU Zhaoqin, FAN Qiwen, HU Xiangnan, LIU Fang, GUO Jian, ZAI Shubei, YANG Hua, SONG Zhigang, WU Wenjuan. The biosafety evaluation of ABSL-3 lab duringMycobacterium tuberculosis animal model construction experiments . Labratory Medicine, 2012, 27(1): 34-38  
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结核分枝杆菌动物建模试验中ABSL-3实验室内生物安全评估
朱召芹1, 范齐文2, 胡香南2, 刘芳3, 郭建2, 宰淑蓓2, 杨华3, 宋志刚1, 吴文娟2
1.复旦大学附属上海市公共卫生临床中心生物安全部,上海 201508
2.复旦大学附属上海市公共卫生临床中心检验科,上海 201508
3.复旦大学附属上海市公共卫生临床中心实验动物部,上海 201508

通讯作者：吴文娟,联系电话：021-37990333-7352。

作者简介：朱召芹,女,1978年生,博士,助理研究员,主要从事结核动物建模和病原体应急检测工作。

基金:"十一五"艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治重大专项(2009ZX10004-505); 上海市科委非政府间国际科技合作项目（10410700300）;
摘要
目的

通过在动物生物安全三级(ABSL-3)实验室内对结核分枝杆菌(MTB)动物建模过程采样监测,为实验室生物安全评估提供依据。

方法

在经中国合格评定国家认可委员会(CNAS)认可并由卫生部批准的,可从事MTB等高致病性病原微生物实验动物研究工作的ABSL-3实验室内实施MTB动物建模,在实验过程中进行空气和物体表面采样。用快速分子诊断和常规病原学方法对样本进行特异性检测分析。

结果

生物安全三级(BSL-3)实验室使用后的清场工作可以大大减少实验室环境的细菌量,BSL-3实验室在日常使用中也会存在少量的环境微生物,由于负压强度和使用频率的差异,核心区的环境洁净度明显高于准备间。70%乙醇喷洒消毒及擦拭可以使准备间物体表面的细菌量检出率从59.26%下降到9.38%;核心区物体表面的环境细菌检出率从6.59%下降到1.52%,核心区MTB检出率从10.99%下降到0。在ABSL-3实验室和生物安全柜双重负压环境下,可避免空气中MTB气溶胶污染。

结论

ABSL-3实验室的负压环境和正确的防护及消毒措施对实验室操作人员的生物安全有重要的防护作用。

关键词: 生物安全评价; 动物生物安全三级实验室; 结核分枝杆菌; 动物建模
中图分类号:R378.91 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)01-34-05
The biosafety evaluation of ABSL-3 lab duringMycobacterium tuberculosis animal model construction experiments
ZHU Zhaoqin1, FAN Qiwen2, HU Xiangnan2, LIU Fang3, GUO Jian2, ZAI Shubei2, YANG Hua3, SONG Zhigang1, WU Wenjuan2
1.Pathogen Diagnosis and Biosafety Department,Shanghai Public Health Clinical Center,Fudan University, Shanghai 201508,China
2. Department of Clinical Laboratory, Shanghai Public Health Clinical Center,Fudan University, Shanghai 201508,China
3. Animal Center, Shanghai Public Health Clinical Center,Fudan University, Shanghai 201508,China
Abstract
Objective

To monitor the sampling process of animal biosafety level 3 (ABSL-3) lab duringMycobacterium tuberculosis (MTB) animal model construction experiments, and provide basis for biosafety evaluation of ABSL-3 lab.

Methods

During the process of MTB model construction, air samples and facility surface samples were collected from the authorized ABSL-3 lab by China National Accreditation Service for Conformity Assessment (CNAS). The rapid molecule technology and traditional pathogenic method were used in samples' specificity detection.

Results

General environmental microbes could be tested in biosafety level 3 (BSL-3) lab,but the core room was cleaner than preparing room most probably because of the negative air pressure and high cleaning frequency. The 70% alcohol can reduce general bacterium detection rate from 59.26% to 9.38%, from 6.59% to 1.52% in preparing room and from 10.99% to 0 in core room. The MTB aerosol contamination was not detected in ABSL-3 and biohazard safety equipment under dual negative pressure.

Conclusions

The appropriate negative air pressure and proper use of biosafety cabinet sterilization measures could help to avoid MTB contamination and ensure the biosafety of ABSL-3 lab.

Keyword: Biosafety evaluation; Animal biosafety level 3 lab; Mycobacterium tuberculosis; Animal model
引言

结核分枝杆菌(MTB)危害级别为二类三级,属高致病性病原微生物[ 1]。MTB大量活菌操作如疫苗制备、动物实验和菌种保存等应在生物安全三级(BSL-3)、动物生物安全三级(ABSL-3)实验室进行[ 2, 3, 4, 5]。在实验室中操作MTB会对个人产生危害。1979至1999年间,世界各地报道的实验室感染中,MTB感染有223例,感染率居首位[ 6]。实验活动中气溶胶的产生是难以避免的。大部分感染的人员主要是因为吸入在处理临床样本和培养物过程中产生的感染性气溶胶所引起[ 5]。因此建立实验室MTB生物安全保障平台,用科学试验建立实验室病原微生物污染的监测和危险评价方法是实验室生物安全科学发展和科学管理的迫切需要,是高致病重大传染病实验室研究急待解决的基本问题。我们在ABSL-3实验室内实施MTB动物建模,对实验过程进行空气和物体表面采样,监测MTB实验室污染状况,并对污染危险因素和相应防护措施的实际效果做出评价,为ABSL-3实验室MTB及其他高致病性病原微生物实验研究提供生物安全保障。

材料和方法
一、材料

1. 主要试剂及耗材 血平板(科玛嘉生物技术有限公司),7H11干粉和油酸、白蛋白、葡萄糖和过氧化氢酶培养基 (OADC,BD公司),15 mL离心管、棉签、采样规格板(5 cm×5 cm)、灭菌生理盐水、磷酸盐缓冲液(PBS,pH值6.8)、N-乙酰-L-半胱氨酸(NALC)-NaOH消化液、中性罗氏培养基、MTB(TB)核酸检测试剂盒(荧光探针基因扩增法,匹基生物公司),16S rDNA鉴定聚合酶链反应(PCR)试剂(上海生工生物技术有限公司)。

2. 仪器 Ⅱ级生物安全柜(ME04073,贝克公司)、PCR仪(Bio-Rad)、CO2恒温培养箱(HF-240)和BIO-RAD iCycler实时荧光定量PCR检测仪。

二、方法

1. 物体表面采样 (1)采样方法:规格板表面用酒精棉球消毒后晾干,取高压灭菌后的棉签,手持棉签的上部,在规格板内部区域充分擦拭,先与边水平方向,再对角线方向,保证棉签涂抹所有的区域;将采样的棉签迅速放入装有灭菌后的2 mL生理盐水的15 mL离心管,将棉签的上半部分折断,旋紧盖子并做好标记,每个物品表面平行采样2次;(2)样本处理:用消毒后的镊子小心将棉签的液体挤出并以棉签涂布血平板,用接菌环三区划分法进行分离培养;挤出的液体离心沉淀集菌,用NALC-NaOH处理后进行MTB培养和核酸检测;(3)核酸定量检测:采用MTB复合群特异PCR-荧光探针法,操作方法参照说明书;(4)血平板采样结果的判定:48 h后观察血平板,记录菌落生长情况并挑取菌落进行革兰染色,观察染色结果且记录;(5)16S rDNA鉴定:挑选需鉴定的菌种,血平板划线纯化菌落,2 d后观察菌落生长情况;在1.5 mL EP管中添加500 μL生理盐水,挑取单个纯化的菌落至EP管中,震荡混匀;将EP管放置到95 ℃金属浴中20 min,以9 300× g离心10 min。取上清作为核酸模板;PCR扩增引物序列:16S rDNA -F 5'-AGTTTGATCCTGGCT CAG-3'和16S rDNA -R 5'-GGTTACCTTGTTACGAC TT-3'。PCR产物由上海博尚生物技术有限公司进行DNA序列测定,再GenBank序列比对分析鉴定菌种;(6)中性罗氏培养基和7H11平板结果的判定:每3天观察1次中性罗氏培养基和7H11平板生长情况,若有污染,涂片后进行萋-尼染色以及革兰染色并镜检;若有疑似MTB菌落生长,涂片后进行萋-尼染色,镜检判断是否为抗酸分枝杆菌;8周后若仍未有分枝杆菌生长,则判定为阴性。

2.FA-2型撞击式空气微生物采样器空气采样 (1)采样方法:FA-2型撞击式空气微生物采样器模拟人体呼吸道的解剖结构及其空气动力学特征,采用惯性撞击原理,将悬浮在空气中的微生物粒子,按大小等级分别收集在采样介质表面上。按仪器操作说明书进行操作。捕获粒子范围:第1级≥8.0 μm,为不可吸入微粒;第2级<8.0 μm,为可吸入微粒(吸入人体下呼吸道)。采样流量:28.3 L/min。每个采样点连续采样3次,每次10 min,分别接种中性罗氏培养基、血平板和含OADC的7H11培养基平板和含5 mL灭菌水的无菌平板中;(2)结果计算:空气中微生物数量是以每立方米空气中所含粒子数量表示,空气中微生物数量(cfu/m3)=所有平皿菌落数/[采样时间(min)×28.3(L/min)]×1 000;空气微生物的大小分布是以各级的菌落数占总菌落数的百分比表示,各级微生物粒子数(%)=该级菌落数/二级总菌落数×100%。

三、统计学方法

应用Graphpad Prizm 5.0统计软件进行统计分析,分别采用 χ2检验对各组检出阳性率进行分析, P<0.05表示为差异有统计学意义。

结果
一、采样点的选择

在ABSL-3实验室的准备间、第2缓冲间和核心区3个空间分别采样,方式分为物体表面采样和空气采样。ABSL-3实验室的布局:由一缓间(压力为-10 Pa)、准备间(压力为-20 Pa)、二缓间(压力为-30 Pa)和核心区组成。核心区又分为BSL-3(压力为-40 Pa)和ABSL-3(压力为-60 Pa)。本研究提及的核心区为ABSL-3,采样实验是以在该区间进行MTB动物实验为背景。布局见 图1。

图1 BSL-3实验室平面示意图

二、样本检测的总体情况

采样实验是在MTB感染动物建模的实验过程中进行的。在建立结核动物模型过程中,为保证多次采样背景环境的一致,小鼠尾静脉注射攻毒、动物换笼、动物解剖等实验是由经过实验动物操作和生物安全培训的专职人员分多次错时平行进行的。ABSL-3实验室表面采样共采样243个,血平板接种培养的样本181个,TB荧光探针检测206个,中性罗氏培养74个。空气采样8次。

三、ABSL-3实验室准备间表面采样情况

ABSL-3实验室准备间共采样86份,其中清场前采样54份,清场后采样32份,包括准备间的实验台、电话机、酶标仪、缓冲间、污物桶和高压锅表面,每个采样表面均至少采集2份。清场前采集样本血平板接种有非MTB细菌生长的有32份,占总采样量的59%(32/54),经涂片检测培养物均为阳性杆菌和/或阳性芽孢杆菌;经16S rDNA序列测定,NCBI Blast比对分析为短芽孢杆菌( Brevibacillus brevis)、唾液链球菌( Streptococcus salivarius)、异养硝化细菌( Bacillus sp)、沃氏葡萄球菌( Staphylococcus warneri)、毗邻颗粒链菌( Granulicatella adiacens);有22份样本未培养出任何细菌。清场后5 min采集32份样本,只有3份分离到培养物,阳性芽孢杆菌、阳性球菌和阳性杆菌各1份,占清场后采集样本的9.38%(3/32),其余29份(90.63%)样本均未培养出任何细菌。结果表明,ABSL-3实验室在日常使用中也会存在少量的环境微生物,ABSL-3使用后的清场工作可以大大减少实验室环境的细菌量,可使准备间物体表面的细菌量检出率从59.26%下降到9.38%,二者差异有统计学意义( χ2=18.701 8, P=0.000 015)。见 表1。

表1 准备间物体表面采样普通环境微生物培养结果
四、ABSL-3实验室核心区表面采样检测结果

ABSL-3实验室核心区共采集157份样本,其中实验过程中的样本91份(包括解剖后小鼠表面采样10份)、清场后样本66份。

1. 核心区普通环境微生物污染情况 核心区实验过程中(清场前)表面采样采集的样本血平皿接种有普通环境微生物生长的有6份,占采样量的6.59%(6/91),采集部位分别为正压防护服的腰带、培养箱的把手、运输瓶盖子、生物安全柜铺巾表面和从准备间传递的下层物品表面,其余均未见细菌生长。核心区清场后采集的样本接种的血平板有2个培养阳性,占采样量的1.52%(1/66)。虽然70%乙醇喷洒消毒可以使核心区物体表面的普通环境微生物检出率从6.59%下降到1.52%,但二者差异无统计学意义( χ2 = 2.315 926, P=0.128 055)。见 表2。这可能与核心区负压环境使该区环境本身的洁净度比较高有关。

表2 核心区物体表面采样普通环境微生物培养结果

2. 核心区MTB污染情况 核心区实验过程中(清场前)有10份样本MTB核酸检测阳性,占总采样量的10.99%(10/91),其中有3份为感染性动物解剖取完脏器后的解剖部位表面,2份为解剖操作人员的手套,1份为安全柜工作台靠外沿,1份为离心机表面(该离心机用来处理小鼠的眼球血),1份为安全柜上表面的紫外、照明和风机按钮处,1份为操作人员的面罩,其余均阴性。核心区清场后采集的样本MTB核酸检测全部阴性。70%乙醇喷洒消毒可以使MTB检出率从10.99%下降到0,二者差异有统计学意义( χ2=6.013 072, P=0.014 200)。见 表3。

表3 核心区物体表面采样MTB核酸检测结果
五、ABSL-3准备间和核心区物体表面采样比较

ABSL-3的准备间和核心区在实验过程中的差别包括:(1)压力,前者压力为-20 Pa,后者压力为-60 Pa;(2)实验操作过程,准备间主要是物品的进出、洁净物品的存储、3M正压防护服的穿脱和包括核心区的实验废弃物的高压等,核心区主要是MTB感染的动物饲养、动物的换笼、动物解剖和脏器处理等。因准备间没有可以使MTB泄露的风险操作,因此采集样本的MTB的检测没有可比性。我们对实验过程中和清场后2个工作区间的采样结果进行比较发现,实验过程中(清场前)准备间普通环境微生物检出率高于核心区,两者差异有统计学意义( χ2= 18.701 838, P=0.000 015);用70%乙醇消毒清场后,2个区域普通环境微生物检出率差异无统计学意义( χ2=1.277 207, P=0.258 409)。见 表4。

表4 ABSL-3准备间和核心区实验过程中清场前、后物体表面普通环境微生物培养结果
六、ABSL-3空气采样情况

在ABSL-3实验室内共空气采样8次,其中2次是在实验结束后清场前准备间采样、2次是在试验结束清场后24 h准备间采样、2次是在实验结束后清场前核心区采样、2次是在实验结束清场后24 h核心区采样。核心区的所有空气采样均未采集到任何细菌,但有1次实验结束后清场前在准备间采集过程的上级平皿采集到6个真菌等环境细菌真菌,即每立方米有21个普通环境微生物。

讨论

BSL-3的生物安全保障是进行各类高致病性病原微生物实验研究的必要前提。实验室生物安全(laboratory biosafety,LBS)指在从事病原微生物实验活动的实验室中避免病原微生物对工作人员和相关人员的危害。随着国家对实验室生物安全的重视,通过BSL-3资质认证的实验室越来越多。为确保实验研究人员的安全,杜绝污染泄漏事件的发生,在BSL-3实际运行过程中进行生物安全监测和评估尤为重要[ 1, 2, 3, 4, 5]。

实验活动中气溶胶的产生是难以避免的,如痰样本混匀、涂片加热固定、培养液的倾倒和转移、离心、细菌定量、匀浆感染组织等。意外事件如培养物的溅出、泼洒和离心管破碎等也可造成严重污染。假如这些小的微滴不能排除的话,他们能进入肺泡并建立原始的感染点。大部分被感染的人员主要是因为吸入在处理临床样本和培养物过程中产生的感染性气溶胶所致。在结核病患者活动较多的医疗卫生单位,医务人员存在较高的感染风险。结核防治工作人员结核病发病水平显著高于一般人群,其中医务人员显著高于非医务人员[ 7]。因此,检测和监测MTB实验活动中实验室环境的污染,评价发生实验室感染的高危因素,是提供科学的生物安全保障措施的基础。

本研究按照国际标准化组织(International Organization for Standardization, ISO)提供的洁净室及相关环境控制——生物污染控制标准(ISO14698 1和2)选择空气、表面生物污染采样仪器和方法进行取样。结果表明,核心区是实验活动中发生污染的高风险区域,是实验操作过程中生物安全防护的重点,因此应加强对该区域的清洁和消毒。核心区动物解剖实验均在生物安全柜内进行,由一名操作者和一名助手协作进行实验,操作者的双手在实验过程中不能离开生物安全柜,物品的传递由助手完成。虽然物品从生物安全柜传出前均进行酒精喷洒消毒,但仍有因酒精消毒时间较短导致操作助手接触病原体并污染其他仪器设备表面的可能。离心机表面、安全柜上表面的紫外、照明和风机按钮操作人员的面罩TB荧光探针检测方法均能检测到致病菌,虽然有可能是灭活的病原体残留,但仍不能排除是活的致病性病原体污染。因此,建议实验操作人员尽量减少实验物品进出安全柜的次数,在进行感染性小鼠解剖等大量接触病原体的操作后,除在生物安全柜内酒精消毒外,双手离开安全柜时应更换外层手套。

本研究的空气采样结果发现,在动物解剖过程中生物安全柜内空气采样未有普通环境微生物和MTB生长。另外同时进行的空气物理颗粒采集分析也没有采集到任何颗粒物(该部分数据另文报道),因此在ABSL-3和生物安全柜双重负压环境下,可避免空气中MTB气溶胶污染。此外,本研究对实验过程中和清场后准备间和核心区这2个工作区域的采样结果表明,实验过程中准备间的普通环境微生物检出率高于核心区;用70%乙醇消毒清场后,2个区域普通环境微生物检出率差异无统计学意义。核心区的负压环境加空气面罩和酒精消毒可以对MTB动物实验操作人员起到完全的生物安全防护,在BSL-3内按现有的防护措施是安全的。因此高致病性病原体的实验在BSL-3内操作是必要的,可以大大减少生物安全事故的发生。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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