引用本文
王瑛, 施雪莺, 高泳. 男性高尿酸血症与URAT1基因多态性的关系 . 2012, 27(1): 30-33
WANG Ying, SHI Xueying, GAO Yong. Association between male hyperuricemia patients in Shanghai and polymorphisms ofURAT1 gene . Labratory Medicine, 2012, 27(1): 30-33  
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男性高尿酸血症与URAT1基因多态性的关系
王瑛, 施雪莺, 高泳
上海市徐汇区中心医院核医学科,上海 200031

作者简介：王瑛,女,1962年生,博士,副主任医师,主要从事医学检验和显像学的工作。

摘要
目的

研究采用非标记探针技术分析中国上海地区汉族人尿酸盐转运子1(URAT1)基因rs893006多态性,以及各基因型与高尿酸患者病理指标的关系。

方法

选取180例原发性痛风患者和260名健康志愿者,记录体重指数、血压,并分别检测血尿酸、血糖、血脂[总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)]、肌酐,提取外周血白细胞的DNA,采用非标记探针技术检测rs893006基因型测序证实。

结果

通过非标记探针能准确区分GG、GT和TT基因型,其结果与测序法一致。GG、GT和TT基因型在痛风和正常人群分布频率分别为53.9%、39.4%、6.7%和55.8%、32.6%、11.6%。痛风组rs893006基因型频率及等位基因频率分布与健康对照组比较差异无统计学意义。各基因型个体的体重指数、血压、肌酐、TC和TG中分布差异无统计学意义,但TT基因型患者的血尿酸水平[(274.00±26.00) μmol/L]明显低于GT 型[(346.00±32.00) μmol/L]和GT型[(438.00±37.00) μmol/L]。

结论

非标记探针技术检测可简便、快速和精确地检测URAT1基因型分析方法。研究证实SLC22A12基因中rs893006基因多态性评估汉族男性人群高尿酸血症危险性的一个遗传学标志。

关键词: 尿酸盐转运子1; 高尿酸血症; 单核苷酸多态性; 痛风
中图分类号:Q754 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)01-30-04
Association between male hyperuricemia patients in Shanghai and polymorphisms ofURAT1 gene
WANG Ying, SHI Xueying, GAO Yong
Department of Nuclear Medicine, the Central Hospital of Xuhui District, Shanghai 200031,China
Abstract
Objective

To investigate the human urate transporter 1 (URAT1) gene rs893006 polymorphism by unlabeled probe technology and the association of genotypes and parameters in hyperuricemia of male Han people in Shanghai.

Methods

A total of 180 patients with primary gout and 260 healthy male subjects were enrolled to this study. Body mass index, blood pressure, serum uric acid, blood glucose, blood lipid [total cholesterol (TC) and triglyeride (TG)] and creatinine were determined. DNA was purified from peripheral blood, and rs893006 polymorphism was determined by unlabeled probe technology followed with sequencing analysis.

Results

GG, GT and TT genotypes were unambiguously distinguished by unlabeled probe technology, and the results were consistent with sequencing. The genotype frequencies of GG, GT, and TT in gout patients and healthy controls were 53.9%, 39.4%, 6.7% and 55.8%, 32.6%,11.6%, respectively. There were no significant differences in distribution of genotype and allele frequencies between gout patients and healthy controls. No statistical significance among the groups was found concerning body mass index, blood pressure, creatinine, TC and TG. However, serum uric acid levels in the TT genotype [(274.00±26.00) μmol/L] were significantly lower than those in the GT [(346.00±32.00) μmol/L] and GG genotypes [(438.00±37.00) μmol/L].

Conclusions

Unlabeled probe technology is a simple, rapid and accurate assay for genotyping theURAT1 gene. The rs893006 polymorphism inSLC22A12 gene was confirmed to be a genetic risk for hyperuricemia among male Han people.

Keyword: Urate transporter 1; Hyperuricemia; Single nucleotide polymorphism; Gout
引言

近年来,大量流行病学研究表明高尿酸血症和痛风的患病率正逐年升高,而且血尿酸水平升高与高血压、脂代谢紊乱、糖尿病及心血管等疾病密切相关,高尿酸血症和痛风已成为威胁人类健康的重要疾病[ 1, 2]。已清楚遗传因素在痛风和原发性高尿酸血症的发生中起着重要作用。具有痛风病家族史的人,无症状高尿酸血症的患病率为25%到27%[ 3]。尿酸主要由肾近端小管重吸收,人尿酸盐转运子1(URAT1)为调节尿酸重吸收的主要蛋白。最近,一个独立的全基因组关联分析(genome-wide association study, GWAS)研究显示 URAT1的基因多态性与血清尿酸水平的升高及痛风相关[ 4]。 URAT1基因位于11q13,有2 642个碱基,10个外显子。 URAT1基因突变将导致其功能缺陷,可发生肾性无症状性低尿酸血症。继日本学者首次报道 URAT1基因突变后,越来越多的研究者发现越来越多的 URAT1的突变谱和SNP位点和血清尿酸的水平相关[ 5]。因此,急需建立一种快速检测 URAT1突变的方法。

非标记探针技术是目前检测基因型的新方法。我们选取居住在上海地区男性原发性痛风患者和健康者进行 URAT1基因型分析,并与传统的测序法比较,研究 URAT1 rs893006基因型与体内尿酸代谢水平之间的关系。

材料和方法
一、研究对象

180例原发性痛风患者,其诊断符合美国风湿病学会的诊断标准,同时选取260例无高尿酸血症和痛风及家族史的健康男性作为对照组。所有患者都采用调查表分析,包括饮食、喝酒、吸烟等信息;糖尿病、痛风和高尿酸血症个人及家族史;血压、体重和身高计算出体重指数。根据诊断标准,男性血清尿酸>420 μmol/L确定为高尿酸血症[ 6]。

二、方法

1. 样本采集及测定 采集空腹静脉血样本。血清尿酸、尿素氮、肌酐、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇醇(LDL-C)采用7600生化分析仪(日本日立公司)检测。

2. 非标记探针分析 使用EDTA抗凝管采集静脉血,并以QIAamp DNA Blood Mini Kit(德国Qiagen公司)试剂盒按厂商说明书提取基因组DNA。使用DN-1000分光光度计(美国Thermo Scientific公司)测定DNA浓度与纯度,在保证核酸纯度相同的条件下使用去离子水稀释至相同DNA浓度(50 ng/μL)备用。使用Primer3软件,根据rs893006位点设计引物,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。序列见 表1,扩增片断长度135 bp。非标记探针中下划线G对应rs893006位点。使用HotStar Taq试剂盒(日本TaKaRa公司),反应体系为:5 U/μL TaKaRa Taq HS 0.1 μL、10×PCR缓冲液 2 μL、2.5 mmol/L dNTP 0.4 μL、H2O 14 μL、前向引物(1/20)0.5 μL、后向引物0.5 μL、非标记探针0.5 μL、0.05 mmol/L SYTO-9 1 μL、DNA样本1 μL,体系总体积20 μL,使用LightCycler 480(瑞士,Roche)按如下反应条件扩增并进行高分辨率熔解分析: 95 ℃Taq酶热启动10 min,94 ℃变性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s、循环60次,72 ℃终末延伸5 min,最终在55 ℃75 ℃进行高分辨率熔解分析,每上升1 ℃采集25次荧光信号。由于探针的3'端被封闭,在聚合酶链反应(PCR)反应过程中不能被Taq 酶延伸。由于上、下游引物的不对称性进行不对称PCR 反应,产生了大量的目标单链DNA可以与探针进行配对,形成局部的双链结构。同时经扩增后的模板DNA形成也会形成双链结构。在发生熔解时,因探针与目标链形成的局部双链比较短,因而Tm 值较低,在比较低的温度下发生解链。随着温度的升高,模板DNA双链发生熔解。与探针配对的目标链上存在SNP 时,就会有非配对碱基的存在,在熔解温度和熔解曲线形状上会和野生型的样本有差别,因而可以对已知位点的SNP 和突变进行基因分型。

表1 PCR反应引物及非标记探针序列

3. 测序分析 随机抽取10例样本,用上述引物在ABI 9700扩增仪上扩增,反应体系除不加SYTO9染料外其余同前,终体积用去离子水补足25 μL。PCR扩增条件同上,产物送上海华大基因科技股份有限公司测序。

三、统计学方法

正态分布计量资料用 x- ±s表示,数据间比较采用 t检验及χ2检验。用Hardy-Weinberg检验确认样本的群体代表性。 P<0.05表示差异有统计学意义。

结果
一、采用非标记探针及测序进行基因分型

加入饱和染料SYTO9和非标记探针后进行的不对称PCR。不对称PCR产生大量的可以与探针互补配对的目标DNA单链,探针与互补的目的单链形成局部的双链结构。经过高分辩溶解分析显示G等位基因对应的Tm 值为 72 ℃ ,T等位基因的Tm值为69 ℃。如果某个样本具有G等位基因和T等位基因的Tm值,那就是杂合型GT(见 图1)。随即选取10例样本进行测序发现,采用非标记探针检测 URAT1基因rs893006基因型的结果与采用测序法的结果之间符合率为100%。

图1 非标记探针技术检测 URAT1基因rs893006所得熔解温度视图

二、 URAT1基因型分布

表2为 URAT1基因rs893006的等位基因和基因型在不同人群中的分布。用χ2检验各基因型与等位基因频率分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律( P>0.05),痛风组和对照组GG、GT、TT基因型的频率分别为:53.90%、39.40%、6.70%和55.80%、32.60%、11.60%。基因型的分布在痛风组与对照组间差异无统计学意义( P>0.05)。

表2 rs893006的等位基因和基因型在不同人群中的分布
三、基因型和尿酸代谢指标关系

根据基因型统计分析身体状况指标与生化指标见 表3。方差分析显示血尿酸水平在3组基因型中差异有统计学意义( P=0.008),TT型组内尿酸的平均水平[(274.00±26.00) μmol/L]明显低于GT 型[(346.00±32.00) μmol/L]和GG型[(438.00±37.00) μmol/L]( P<0.05)。年龄、体重指数、血压、TC、TG和肌酐在各组间差异均无统计学意义( P>0.05)。

表3 不同基因型个体的各项指标的比较 x- ±s
讨论

高尿酸血症是痛风的重要危险因子,90%的患者是肾脏尿酸排泄减少, URAT1被认为是肾脏尿酸代谢的阴离子交换器,最近被证实其为肾调节外周血尿酸水平的主要吸收转运蛋白。 URAT1基因突变将导致其功能缺陷,可能发生肾性无症状性低尿酸血症[ 7]。 URAT1基因多态性联合尿酸排泄减少和高尿酸血症证实了 URAT1在肾脏尿酸重吸收中决定性的角色。本研究中4号内含子上 URAT1基因的rs893006基因多态性,受试者为无血缘关系的原发性痛风患者和健康志愿者。同时研究基因多态性和体内尿酸水平之间关系,在男性中,3个基因组间发现TT型基因的尿酸较低,差异具有统计学意义( P<0.05)。

最近,Shima等[ 8]研究日本 URAT1基因的rs893006基因多态性与血清尿酸关系,本研究结果和他们的结果类似,均显示TT基因型的个体的尿酸水平最低,显示这个单核苷酸多态性可能为中国人高尿酸血症的遗传危险因子。对德国人群中 URAT1基因多态性的研究显示[ 9]:在 URAT1启动子上的A788T突变、外显子1上C258T突变和外显子2上C426T突变均导致尿酸分级排泄(FEUA)递减。他们还发现 URAT1基因C426T突变中的CC基因型个体中尿酸的水平明显低于CT基因型和TT基因型,显示 URAT1在不同种族的人群中不同的易感SNP。本研究也是首次探索了中国汉族痛风患者 URAT1基因易感传点。

非标记探针技术是对已知位点的SNP和突变研究的一种廉价、简便、快速准确的基因分型技术。目前已成功地用于相关遗传疾病检测,如因子 V Leiden 突变[ 10] 、囊性纤维化的热点突变[ 11]和单纯性疱疹病毒的分型等[ 12]。本研究中非标记探针结果和测序结果百分之百符合,显示其在临床分子检测中具有广泛的实用价值,适合在临床推广。

The authors have declared that no competing interests exist.

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