引用本文
陆兴热, 温柏平, 代宏剑, 高仕萍, 刘孝文. 结肠癌PIK3CA基因G1876A突变的意义 . 2012, 27(1): 26-29
LU Xingre, WEN Baiping, DAI Hongjian, GAO Shiping, LIU Xiaowen. The significance ofPIK3CA gene G1876A mutation in colon carcinoma . Labratory Medicine, 2012, 27(1): 26-29  
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结肠癌PIK3CA基因G1876A突变的意义
陆兴热1, 温柏平2, 代宏剑2, 高仕萍1, 刘孝文1
1.云南省文山州人民医院,云南 文山县 665000
2.昆明市儿童医院,昆明市儿童医学检验中心,云南 昆明 650034

通讯作者：温柏平,联系电话：0876-2122714。

作者简介：陆兴热,男,1972年生,学士,主管技师,主要从事分子生物学诊断工作。

摘要
目的

寻找结肠癌中磷脂酰肌醇激酶-3(PIK3CA)基因的突变位点,结合结肠癌计算机断层扫描(CT)分期资料分析其意义。

方法

收集结肠癌组织78例和癌旁组织30例,通过聚合酶链反应(PCR)扩增PIK3CA第12和20外显子,单核苷酸多态性(SSCP)进行筛查,再用测序法确证,并对照经CT检查Dukes临床病理分期资料进行分析。

结果

结肠癌样本SSCP和DNA测序在PIK3CA第20外显子未发现突变,第12外显子有16例(20.51%)样本发生G1876A突变,突变样本均位于Dukes分期的A期和B期;而30例癌旁组织样本PIK3CA第12和20外显子均未发现突变。

结论

PIK3CA基因G1876A突变可能在结肠癌发生中起着重要的作用,第12外显子基因分析对早期结肠癌患者的诊断有重要意义。

关键词: 磷脂酰肌醇激酶-3基因; 基因突变; 基因分析; 单核苷酸多态性; 测序
中图分类号:Q753 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2012)01-26-04
The significance ofPIK3CA gene G1876A mutation in colon carcinoma
LU Xingre1, WEN Baiping2, DAI Hongjian2, GAO Shiping1, LIU Xiaowen1
1. Wenshanzhou People's Hospital, Yunnan Wenshan 665000, China
2. Kunming Children's Hospital,Kunming Children's Laboratory Diagnostic Center,Yunnan Kunming 650034, China
Abstract
Objective

To detect the mutations of phosphatidylinositol 3-kinase catalytic alpha polypeptide (PIK3CA) gene in colon carcinoma, and analyze the relation and significance with computerized tomography (CT) stages.

Methods

The tumor tissues (78 cases) and tumor-adjacent tissues (30 cases) of colon carcinoma were collected. The exon 12 and exon 20 ofPIK3CA gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and examined by single-strand conformation polymorphism (SSCP) and sequenced. With the CT stages, the data of Dukes stage were analyzed.

Results

In tumor tissues, after the SSCP examination and sequencing, there was no mutation happened in the exon 20, and there were 16(20.51%) cases of the exon 12, which all changed with G1876A mutation in Dukes A stage and B stage. In contrast, all the tumor-adjacent tissue cases were not found mutation in exon 12 and exon 20.

Conclusions

The mutation G1876A ofPIK3CA gene plays an important role in the genesis of colon carcinoma, and it is useful to analyze and diagnose early colon carcinoma by the detection of exon 12.

Keyword: Phosphatidylinositol 3-kinase catalytic alpha polypeptide gene; Gene mutation; Gene analysis; Single-strand conformation polymorphism; Sequence
引言

结直肠癌是较常见的恶性肿瘤,发病率在我国呈逐年上升趋势。结直肠癌的发病类型可将其分为散发性、家族性与遗传性3 类,散发性结直肠癌,约占结直肠癌的70%,是由体细胞基因突变而产生的,可能与饮食、环境等因素有关。

磷脂酰肌醇激酶-3(PIK3)是一类特异性磷酸化肌醇磷脂羟基激酶,PIK3CA是 PIK3 催化亚单位α基团,并且是PIK3家族的关键成员。细胞外信号调节激酶(AKT)是PIK3CA下游重要靶分子。研究发现PIK3-AKT信号调节途径与细胞增殖和存活、细胞活动和黏附、细胞分化、细胞支架结构的重排和细胞内运输都有密切联系[ 1]。 PIK3 CA基因定位于3q26,含20个外显子,编码1 068个氨基酸。现已证实 PIK3 CA是一种原癌基因[ 2],在结肠癌、脑癌、乳腺癌、胃癌和肝癌里 PIK3 CA有较高的突变率。在已发现的 PIK3 CA基因突变中,少部分发生在第12外显子和第1外显子,大部分基因突变都集中在其第9和第20外显子的特异性位点上。我们通过聚合酶链反应(PCR)-单核苷酸多态性(SSCP)和测序法检测 PIK3 CA基因第12外显子和第20外显子热点突变区的DNA序列,探讨 PIK3 CA基因突变与结肠癌发生和分期之间的关系。

材料和方法
一、样本来源

所有样本来源于昆明医学院第一附属医院、昆明医学院第二附属医院文山州人民医院,并取得患者的知情同意。

1. 结肠癌组 结肠癌腺癌患者78例,均经过病理组织学检查确诊,其中男55例、女23例,年龄5369岁,结肠组织样本经手术切除后冰冻保存。所有患者经CT检查,结肠呈局限性增厚,形成乳头状突起,表面伴有糜烂与小溃疡,组织进行病理检查明确有无局部淋巴结浸润和远处转移。Dukes临床病理分期:A期36例、B期20例、C期13例、D期9例。

2. 癌旁组织组 从78例结肠癌患者中随机选取30例患者,男18例,女12例,年龄5268岁,在内窥镜下手术切取结肠癌癌旁组织,并经病理检测无癌细胞存在,冰冻保存。

二、试剂与仪器

基因组DNA提取试剂盒购自大连TaKaRa生物技术公司,2×PCR Super Mix购自北京威格拉斯生物技术有限公司, BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit和polymer POP-7购自美国ABI公司。C1000 Thermal Cycler 为美国Bio-Rad公司产品,3130XL测序仪为美国ABI 公司产品,EC3 Imaging System为美国UVP公司产品。

三、组织DNA提取

用生理盐水洗净结肠癌和癌旁组织样本,剪取约150 mg于1.5 mL离心管中,按Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒说明书操作提取DNA,抽提好的DNA样本经紫外分光光度计检测吸光度( A)260 nm/ A280 nm值>1.82。

四、引物

用Primer 5.0软件设计,由上海Invitrogen公司合成。 PIK3 CA基因第12外显子上游引物:5'-GGCAGTGTTTTAGATGGCTCATT-3',下游引物:5'-TTCTGCATGGCCGATCTAAAG-3';第20外显子上游引物:5'- CTCAATGATGCTTGGCTCTG-3',下游引物:5'- TGGAATCCAGAGTGAGCTTTC-3'。

五、PCR扩增

反应体系:2×PCR Super Mix 12.5 μL、上、下游引物(10 pmol/μL)各1 μL、DNA 2μL、ddH2O 8.5 μL,总体积25 μL。反应条件:94 ℃ 5 min;然后93 ℃ 30 s,56(第20外显子52 ℃) 45 s,72 ℃ 45 s,40个循环;72 ℃ 7 min。

六、PCR-SSCP检测

取3 μL PCR产物与6 μL上样缓冲液(含95%去离子甲酰胺、0.03%溴酚蓝、0.01 mol/L EDTA,pH值8.10),98 ℃变性10 min后立即置于冰上放置10 min,上样于10%聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺∶双丙烯酰胺=25∶1),用0.5×TBE缓冲液,室温下电泳56 h,0.2%硝酸银染色观察结果。

七、 PIK3 CA基因序列测定

PIK3 CA基因序列测定在ABI 3130XL DNA测序仪上进行,序列图谱采用DNA序列分析软件Bioedit7.0进行数据分析,并与GenBank上公布的 PIK3 CA(NG_012113)基因第12外显子和20外显子序列进行比对。

结果
一、PCR扩增产物鉴定

8 μL PCR产物加1 μL溴酚蓝混匀,1.5%琼脂糖凝胶100 V×30 min电泳,凝胶成像系统扫描观察结果。78例结肠癌组织和30例癌旁组织样本中 PIK3 CA基因第12外显子(扩增片段长度418 bp)与第20外显子(扩增片段长度241 bp)均有清晰明亮的PCR目的扩增条带,无杂带,可用于进一步SSCP和测序分析。见 图1。

图1 PIK3 CA基因第12外显子和第20外显子PCR扩增产物鉴定电泳图注:M为边准条带;1为结肠癌第20外显子扩增样本;2为癌旁组织20外显子扩增样本,在241 bp处有阳性条带;3为结肠癌第12外显子扩增样本;4为癌旁组织12外显子扩增样本,在418 bp处有阳性条带

二、SSCP检测结果

78例结肠癌患者组织样本中 PIK3 CA基因第20外显子示均未出现异常电泳条带;有16例第12外显子出现异常条带。癌旁组织样本第12外显子和第20外显子均未出现异常条带,见 图2。

图2 PIK3 CA基因第12外显子SSCP电泳图注:3为结肠癌样本[出现异常条带(箭头处)];4为癌旁组织样本(未见异常条带);5为结肠癌样本(未见异常条带)

三、测序结果

测序显示78例结肠癌患者组织样本 PIK3 CA基因第20外显子序列未发现突变,有16例 PIK3 CA基因第12外显子发现突变(G1876A/Asp 626 Asn),见 图3、 图4。测序峰图为子突变位点出现套峰,突变率为20.51%,突变样本与SSCP结果异常样本一致。16例第12外显子突变样本中。Dukes分期A期5例、B期11例。30例癌旁组织组织样本中 PIK3 CA基因第12和20外显子碱基均无突变,见 图4、 图5。

图3 结肠癌组织中 PIK3 CA基因第12外显子突变测序图注:箭头处为突变发生位点

图4 结肠癌组织和癌旁组织 PIK3 CA基因第12外显子序列在Bioedit7.0上的比对图注:NM 006218.2为GenBank里的参考序列;2、4为癌旁组织; 1、3为结肠癌突变样本(G1876A,GAC突变为AAC);5为结肠癌未发现突变样本

图5 PIK3 CA基因第12外显子正常测序图注:和 图3比对箭头处未发生突变

讨论

在美国,结直肠癌发病率位居肿瘤第2位,仅次于肺癌。我国2000年的流行病学资料表明,城市和农村结直肠癌死亡率分别达到1 119/10万和604/10万,结直肠癌成为严重威胁人民群众生命健康的杀手。癌基因的激活突变和抑癌基因的失活突变是引起结直肠癌的重要方式。研究表明, PIK3 CA基因突变使PI3Ks激酶活性大大增加,增强下游信号分子AKT磷酸作用[ 6],现已发现,在多种人类恶性肿瘤组织中存在频繁的PIK3-AKT信号通路的异常改变[ 3, 4, 5, 6]。

Karakas等[ 5]报道了3次原发结直肠癌 PIK3 CA基因突变检测结果,突变率分别为31.6%、13.6%、18.8%,同时表明通过检测第9、20 及以外的更多外显子可以提高 PIK3 CA基因突变检出率。本研究先通过PCR-SSCP方法筛查了78例结肠癌和30例癌旁组织样本 PIK3 CA基因第12外显子和第20外显子,再用测序方法进行确证。结果表明78例结肠癌有16例发生点突变,突变位点位于第12外显子第1876位碱基,G变为A;626位氨基酸Asp变为Asn。突变率为20.51%,并且均发生在Dukes分期的A期和B期。这表明 PIK3 CA基因该位点突变对老年散发性结肠癌的发病有重要作用。因此,通过分子生物学方法检测该突变位点对预防、警示老年患结肠癌风险具有一定的积极意义。当然,G1876A突变对结肠癌的病程和病理作用仍需进一步研究。本研究结肠癌组织及癌旁组织 PIK3 CA基因第20外显子未发现突变,可能与本研究PCR扩增片段较短以及样本选择有一定关系。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Morrow CJ, Gray A, Dive C. Comparison of phosp-hatidylinositol-3-kinase signalling within a panel of human colorectal cancer cell lines with mutant or wild-type PIK3CA[J]. FEBS Lett, 2005, 579(23): 5123-5128. [本文引用:1] [JCR: 3.582]
[2] Franke TF, Yang SI, Chan TO, et al. The protein kinase encoded by the Akt proto-oncogene is a target of the PDGF-activated phosphatidylinositol 3-kinase[J]. Cell, 1995, 81(5) : 727-736. [本文引用:1] [JCR: 31.957]
[3] Bachman KE, Argani P, Samuels Y, et al. The PIK3CA gene is mutated with high frequency in human breast cancers[J]. Cancer Biol Ther, 2004, 3(8): 772-775. [本文引用:1] [JCR: 3.287]
[4] Broderick DK, Di C, Parrett TJ, et al. Mutations of PIK3CA in anaplastic oligodendrogliomas, high-grade astrocytomas, and medulloblastomas[J]. Cancer Res, 2004, 64(15): 5048-5050. [本文引用:1] [JCR: 8.65]
[5] Karakas B, Bachman KE, Park BH, et al. Mutation of the PIK3CA oncogene in human cancers[J]. Br J Cancer, 2006, 94(4): 455-459. [本文引用:2]
[6] Gao T, Furnari F, Newton AC. PHLPP: a phosphatase that directly dephosphorylates Akt, promotes apoptosis, and suppresses tumor growth[J]. Mol Cell, 2005, 18(1): 13-24. [本文引用:2] [JCR: 15.28]