引用本文
孙贞, 李瑞东, 周琳, 王正昕, 仲人前. 肝移植术后早期白细胞分类计数与CD4+T细胞ImmuKnow法ATP值的相关性研究 . 2011, 26(9): 615-618
SUN Zhen, LI Ruidong, ZHOU Lin, WANG Zhengxin, ZHONG Renqian. Correlation research on the early stage white blood cell count and ATP value in CD4+T cell by ImmuKnow method after liver transplantation . Labratory Medicine, 2011, 26(9): 615-618  
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肝移植术后早期白细胞分类计数与CD4+T细胞ImmuKnow法ATP值的相关性研究
孙贞1, 李瑞东2, 周琳1, 王正昕2, 仲人前1
1. 第二军医大学附属长征医院实验诊断科,上海 200003
2. 第二军医大学附属长征医院器官移植中心,上海 200003

作者简介:孙贞,女,1978年生,硕士,主管技师,主要从事病毒感染与免疫的研究。通讯作者:仲人前,联系电话:021-81886071

摘要
目的

探讨临床常用的白细胞(WBC)分类计数与ImmuKnow法检测CD4+T细胞内的腺苷三磷酸(ATP)值的相关性,为临床提供一种快速判断细胞免疫功能的方法。

方法

选择50例行经典原位肝移植术受者术后1周至1个月内的样本,进行WBC分类计数并采用ImmuKnow法检测CD4+T细胞内ATP值,分析两者的相关性。随机选择5例肝移植受者于术后1、2、3、4、5周分别重复检测上述指标,进一步验证两者动态变化的相关性。

结果

50例行肝移植受者ImmuKnow法ATP值为446.7±219.1μg/L,WBC总数为(8.08±3.62)×109/L,与ImmuKnow法ATP值的相关系数(r)为0.659(P<0.001);中性粒细胞计数为(6.07±3.07)×109/L,与ImmuKnow法ATP值的r为0.593(P<0.001);单核细胞计数为(0.53±0.25)×109/L,与ImmuKnow法ATP值的r为0.371(P=0.006)。淋巴细胞计数为(1.13±0.69)×109/L,与ImmuKnow ATP值无相关关系(r=0.138,P=0.135)。5例肝移植受者术后重复检测,WBC总数的变化与ImmuKnow 法ATP值的变化呈正相关,r均>0.5,但由于样本量较少,仅有1例差异有统计学意义。

结论

肝移植术后早期WBC计数与CD4+T细胞ImmuKnow法 ATP值具有一定的正相关性,WBC计数的变化可以在一定程度上反映ImmuKnow 法ATP值的变化。

关键词: 白细胞计数; CD4+T淋巴细胞; 肝移植
中图分类号:R446.1 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)09-0615-04
Correlation research on the early stage white blood cell count and ATP value in CD4+T cell by ImmuKnow method after liver transplantation
SUN Zhen1, LI Ruidong2, ZHOU Lin1, WANG Zhengxin2, ZHONG Renqian1
1. Department of Laboratory Diagnotics,Changzheng Hospital,Second Military Medical University,Shanghai 200003, China
2. Organ Transplant Center, Changzheng Hospital,Second Military Medical University,Shanghai 200003, China
Abstract
Objective

To investigate the correlation between blood white blood cell (WBC) count and adenosine triphosphate (ATP) value in CD4+T cell by ImmuKnow method, so as to provide a method to rapidly identify cellular immune function.

Methods

A total of 50 recipients of classic orthotopic liver transplantation (OLT) were enrolled. The 50 samples of recipents from 1 week to 1 month after the transplanting operation were collected for the determination of relativity between WBC count and ATP value in CD4+T cell by ImmuKnow method, and samples of 5 recipents selected randomly were collected for duplicated determination of the indices in Week 1, 2, 3, 4 and 5 after the transplanting operation to further verify the correlation of their dynamic changes.

Results

WBC count had the high correlation with ATP value by ImmuKnow method atr=0.659 (P<0.001), followed by neutrophile granulocyte count [(6.07±3.07)×109/L] atr=0.593 (P<0.001) and mononuclear cell count [(0.53±0.25)×109/L] atr=0.371(P=0.06). Lymphocyte count[(1.13±0.69)×109/L] was insignificant for ATP value by ImmuKnow method (r=0.138,P=0.135). The 5 recipents were repeatedly tested for ATP values by ImmuKnow method, which were positively correlated to WBC counts withr>0.5. However, the number of samples was minimal, so only 1 sample was significant for statistics.

Conclusions

WBC count in early stage after the liver transplantion has some positive correlation with ATP value in CD4+T cell by ImmuKnow method, and the changes of WBC count can reflect the changes of ATP value to some extent.

Keyword: White blood cell count; CD4+T lymphocyte; Liver transplantation

CD4+T淋巴细胞的活化状态是免疫进入特异性反应阶段的前提。国际多中心研究表明,检测全血样本中CD4+ T淋巴细胞内抗原刺激后腺苷三磷酸(ATP)含量可以很好地定量反映细胞免疫功能[ 3] 。然而,ImmuKnow法检测在我国还未正式进入临床应用,价格昂贵且需时较长。国外有研究分别提及心脏[ 4]、肾脏[ 5]移植术后ImmuKnow法ATP值与白细胞(WBC)计数呈正相关。我们拟研究肝移植术后ImmuKnow法ATP值与WBC计数及其分类的相关性,评价采用廉价快速的血常规检测替代ImmuKnow法检测的可能性。

材料和方法
一、免疫抑制剂治疗方案

1.材料 他克莫司(商品名:普乐可复),安斯泰来公司; 霉酚酸酯(商品名:晓悉),罗氏公司; 甲泼尼龙(商品名:甲强龙),辉瑞公司。

2.方法 所有患者术后均采用他克莫司(FK506)+ 霉酚酸酯(MMF)+ 甲泼尼龙的三联疗法。FK506剂量为0.05~0.10 mg/kg,口服,1次/12 h。术中无肝期甲基强的松龙(MP)500 mg静脉滴注,术后第1天MP 240 mg静脉滴注,以后每天减量40 mg,术后第7天开始口服强的松20 mg。肝癌患者1个月内停用激素,非肝癌患者3个月内停用激素。霉酚酸酯0.5 g,口服,1次/12 h。术后根据FK506血药浓度的监测及时调整剂量,维持其浓度在8~12 ng/mL。

二、研究对象

2009年2月至2009年10月在第二军医大学附属长征医院器官移植中心行经典原位肝移植术的住院患者。排除标准:(1)术前有感染;(2)合并脾脏切除;(3)有严重手术并发症(血管栓塞或狭窄、胆瘘或胆道狭窄);(4)原发性供肝无功;(5)合并肾功能衰竭。随机选择50例肝移植受者,于术后1周至1个月内监测其WBC分类计数、CD4+T细胞ImmuKnow法ATP值,其中男31例,女19例,年龄33~64岁。受体原发疾病包括原发性肝癌25例、乙型肝炎后肝硬化20例、原发性胆汁性肝硬化4例、酒精性肝硬化1例。供、受体A、B、O血型相同。随机选择5例肝移植受者于术后1、2、3、4、5周分别重复检测上述指标,验证WBC计数动态变化与ImmuKnow法ATP动态变化的相关性。

三、CD4+T细胞内的ATP含量检测方法

1.仪器与试剂 照度器(Luminometer);微量板振荡仪;ImmuKnow 试剂盒(美国Clylex公司产品)。

2.检测方法 留取所有患者全血样本3 mL,按照ImmuKnowTM试剂盒说明书进行操作。在样本收集后6 h内进行淋巴细胞刺激培养,次日测定CD4+T细胞的ATP值。该测试的基本原理是利用植物血凝素(PHA)刺激新鲜血液样本中的淋巴细胞,促进淋巴细胞活化,并伴随ATP合成酶的增加,再将细胞置于37 ℃、5% CO2的孵育箱中培养15~18 h。再用特殊磁珠分选出其中的CD4+T细胞,接着加入细胞消化液,使细胞裂解,释放出细胞内的ATP,最后加入发光试剂(荧光素和荧光素酶)与ATP发生反应,将样本的荧光光照度与标准品的定标曲线相对比,得出样本的ATP值。

四、WBC分类计数检测

1.仪器与试剂 Sysmex XE-2100及SP-1000i全自动血液分析仪(日本Sysmex 公司生产)。试剂均为原装配套试剂,包括:CELLPACK(EPK)、CELLSHEATH(ESE)、STROMATOLYSER-FB(FBA)、STROMATOLYSER-4DL(FFD)、 STROMATOLYSER-4DS(FFS)、STROMATOLYSER-NR[溶血素,染料溶液(SNR)]等。

2.方法 采集患者外周血样本2 mL,乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝,自动混匀器摇匀待检。6 h内Sysmex XE-2100及SP-1000i全自动血液分析仪检测,按照操作要求进行。WBC及其分类使用半导体激光器的流式细胞计数方法,数据自动传输到工作电脑。

五、统计学方法

采用SPSS 17.0 统计软件。结果用 ±s表示,符合正态分布的数据采用Pearson相关分析,非正态分布的数据采用Spearman等级相关分析, P<0.05表示差异有统计学意义。

结果
一、肝移植术后早期WBC及分类计数与CD4+T细胞ImmuKnow法ATP值的相关性

50例肝移植受者Immuknow法ATP值为(446.7±219.1)μg/L。WBC总数为(8.08±3.62)×109/L,与ImmuKnow法ATP值呈正相关[相关系数( r)=0.659, P<0.001],见 图1。中性粒细胞计数为(6.07±3.07)×109/L,与ImmuKnow法ATP值呈正相关( r=0.593, P<0.001)。单核细胞计数为(0.53±0.25)×109/L,与ImmuKnow法ATP值呈正相关( r=0.371, P<0.006)。淋巴细胞计数为(1.13±0.69)×109/L,与ImmuKnow法ATP值无相关性( r=0.138, P<0.135。)

图1 WBC总数与ImmuKnow法ATP值的相关性

二、WBC计数的动态变化与ImmuKnow ATP值动态变化的相关性

5例肝移植受者术后定期重复测量WBC计数与ImmuKnow ATP值的动态变化结果(见 表1)。可见两者呈正相关( r>0.5)。但由于单例患者检测样本因住院时间有限,样本量较少,仅有1例受者的相关性差异有统计学意义。但是仍可看出有同步变化的趋势(见 图2),为使WBC计数与ATP值的变化置于同一图中,将WBC计数由×109/L转换为×107/L,使其与ATP值处于同一数量级。

表1 5例肝移植受者WBC计数(×107/L)与ImmuKnow ATP值动态变化

图2 5例肝移植受者各自WBC计数与ImmuKnow ATP值动态变化

讨论

2002年美国批准体外检测CD4+T细胞活化后细胞内ATP浓度的方法——ImmuKnow TM用于移植后量化评估细胞免疫功能[ 6]。但是最近有文献提出单次检测ImmuKnow ATP值不能准确预测移植术后机会性感染和急性排斥反应的发生[ 7]。所以监测ImmuKnow ATP值动态变化能更好判断移植受者的细胞免疫功能。但是ImmuKnow 检测单次成本在千元左右,费用较昂贵,动态监测更明显增加医疗费用,在我国还未被列入临床收费项目,仅在部分移植中心用于临床科研,不利于临床大量常规应用。

心脏[ 4]、肾脏[ 5]移植术后细胞免疫功能监测的相关研究中提及WBC与ImmuKnow ATP值成正相关,Pearson'R分别为0.64和0.466。目前未见肝移植术后WBC计数与ImmuKnow ATP值相关性研究的报道。WBC是多形核粒细胞、淋巴细胞和单核细胞的总称,是一个庞大的血细胞家族,他们的形态结构和生理功能是多样的,但他们之间不是相互孤立的,在机体的防护、免疫和创伤愈治过程中起协同作用。WBC及其分类计数的变化反映了免疫系统对外源性和或内源性各种刺激的综合反应。而ImmuKnow ATP值是CD4+T细胞在体外对抗原刺激的反应活性,代表受者免疫反应的潜在能力,并非体内实际值。所以,从理论上讲,WBC跟CD4+T细胞ImmuKnow ATP值两者都是反映了机体对于抗原刺激作出的反应,应该存在一定的同向变化关系。

本研究发现肝移植术后患者WBC计数与ImmuKnow ATP值成正相关,且相关性最高, r为0.659,与其他移植领域结果相似。在WBC分类中,中性粒细胞计数的相关性最高,可能是因为在应激反应中,中性粒细胞的反应最为迅速;单核细胞计数与ImmuKnow ATP值 r虽然差异有统计学意义,但 r<0.5;国外研究报道ImmuKnow ATP值与CD4+T淋巴细胞计数无相关性[ 2],与之相似,在本研究中ImmuKnow ATP值与淋巴细胞计数也无明显相关性。

通过对5例肝移植受者术后连续重复检测WBC计数及ImmuKnow ATP值,可见两者的波动变化存在正相关,呈现同向变化的特征,且 r高于不同受者间所得的数值。说明WBC的变化在一定程度上可以反映ImmuKnow ATP值的变化,能较好地反映细胞免疫功能的变化。但由于ImmuKnow ATP值检测价格昂贵,经费有限,本研究只选择了5例肝移植受者进行重复检测,样本量较少。若条件允许,可增大样本量,作进一步研究,则更具有说服力。在临床应用时可以联合ImmuKnow ATP值和WBC及分类计数监测移植术后免疫功能的动态变化,减少ImmuKnow检测的次数,增加血常规检测的次数达到事半功倍的效果。

综上所述,肝移植术后早期WBC计数与CD4+T细胞ImmuKnow ATP值具有一定的正相关性,WBC计数的变化可以在一定程度上反映ImmuKnow ATP值的变化。而且血常规检测价格低廉,符合我国国情,减少患者和社会医疗保险的经济负担。实际上,本身血常规在移植术后一直要定期检测,只是还没有把结果充分利用起来。所以,我们可以尝试应用WBC计数代替ImmuKnow ATP值,为肝移植术后细胞免疫状态的临床判断提供一种方便、快速、廉价的方法。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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