引用本文
张薇薇, 张军, 方超平, 沈茜. 红细胞CD55、CD59流式细胞术检测方法的若干影响因素探讨. 2011, 26(9): 610-614
ZHANG Weiwei, ZHANG Jun, FANG Chaoping, SHEN Qian. Investigation of several influential factors on flow cytometry analysis of CD55 and CD59 expression on red blood cells. Labratory Medicine, 2011, 26(9): 610-614  
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红细胞CD55、CD59流式细胞术检测方法的若干影响因素探讨
张薇薇, 张军, 方超平, 沈茜
第二军医大学附属长海医院实验诊断科,上海 200433

作者简介：张薇薇,女,1982年生,学士,技师,主要从事临床流式细胞术和分子生物学检验工作。

摘要
目的

探讨流式细胞仪测定红细胞表面CD55、CD59试验过程中影响检测的若干因素,建立此项目的标准操作程序。

方法

利用流式细胞仪对15例非血液病、11例阵发性血红蛋白尿症(PNH)的乙二胺四乙酸(EDTA)外周抗凝血进行红细胞CD55、CD59检测,观察单克隆抗体(mAb)用量、荧光素种类及反应时间对测定结果的影响。

结果

在未饱和抗原的情况下(<9 μL),平均荧光强度(MFI)随抗体量的增加而升高。CD55-异硫氰酸荧光素(FITC)的阳性率和MFI均低于CD55-藻红蛋白(PE),CD59的FITC和PE 2种荧光标记的阳性率间差异无统计学意义,但在MFI方面前者明显高于后者。反应时间对CD55-PE阳性率、CD59-FITC和CD55-PE的MFI有明显影响(P<0.05);3 h内2组CD59-FITC的阳性率无明显变化。

结论

抗体用量、荧光素种类及标记模式和温育时间对流式细胞仪检测红细胞CD55、CD59有明显的影响。本实验室在3个影响因素上分别选择12 μL 抗体标记1.6×105~2.8×105个红细胞、荧光素组合模式为CD59-FITC、CD55-PE双色标记和40 min的温育时间,这样既确保了反应充分又提高了结果的稳定性。

关键词: 流式细胞术; CD55; CD59; 红细胞; 阵发性睡眠性血红蛋白尿
中图分类号:R446.11 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)09-0610-05
Investigation of several influential factors on flow cytometry analysis of CD55 and CD59 expression on red blood cells
ZHANG Weiwei, ZHANG Jun, FANG Chaoping, SHEN Qian
Department of Laboratory Diagnosis,Changhai Hospital,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China
Abstract
Objective

To study some factors that may influence the measurements of CD55 and CD59 expression on red blood cells by flow cytometry and establish the standard operation procedure.

Methods

Ethylene diamine tetraacetic acid(EDTA)-anticoagulated peripheral bloods from 15 patients with non-hematological disorder and 11 patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) were determined for CD55 and CD59 expression on red blood cells by flow cytometry. The various amounts of monoclonal antibody (mAb), the fluorescein type that conjugated with mAb and the staining time were analyzed.

Results

The mean fluorescence intensity (MFI) increased with the increasing amount of mAb before the saturated amount of mAb (<9 μL) were added. The positive rates and MFI from using anti-CD55 labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) were lower than those from anti-CD55-phycoerythrin (PE). There was no statistical significance in CD59 positive rate between FITC and PE, while the higher MFI was observed significantly using anti-CD59-FITC. The staining time had a significant impact on not only the positive rate of CD55-PE but also the MFI obtained from CD59-FITC and CD55-PE (P<0.05), except the CD59-FITC positive rate between the 2 groups with 3 h.

Conclusions

The flow cytometry analysis of CD55 and CD59 expression on red blood cells is strongly influenced by the mAb amount, the mAb's fluorescein type and staining time. To ensure a proper reaction and a reliable result, we recommend a two-color staining method of anti-CD59-FITC and anti-CD55-PE, red blood cells in the range from 1.6×105 to 2.8×105 stained with 12 μL of each mAb and an incubation time of 40 min.

Keyword: Flow cytometry; CD55; CD59; Red blood cell; Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria

衰变加速因子(CD55,DAF)和反应性膜溶血抑制物(CD59,MIRL)是正常细胞膜上的糖化磷脂酰肌醇(glycophosphatidyl inositol,GPI)锚蛋白,参与补体系统的免疫功能。一直以来,上述2种补体调节蛋白的表达与造血干细胞克隆性疾病的关系被临床医师和学者广泛关注,尤其是在阵发性血红蛋白尿(paroxysmal nocturnal hemog-lobinuria,PNH)诊断及鉴别诊断方面。使用高敏感性的流式细胞仪和特异的单克隆抗体逐渐成为定量分析CD55、CD59的重要手段。但由于目前此检测项目缺乏统一操作规程和判断标准,导致无法进行室间对比。为了保证检验结果的可靠性及可比性,我们现对抗体荧光素种类选择、抗体使用量及反应时间等因素进行探讨,建立本实验室红细胞CD55、CD59流式细胞术检测的标准操作程序,减少室内变异性,从而保证结果稳定和可靠。

材料和方法
一、材料

1.试剂 Mouse anti-human mAb CD55-异硫氰酸荧光素(FITC)、CD55-藻红蛋白(PE)、CD59-FITC、CD59-9PE,同型对照抗体Mouse IgG2a-FITC和IgG2a-PE。CD55克隆号为IA10,CD59克隆号为P28(H19)。所有抗体均为美国BD PharmingenTM公司产品。自配的磷酸盐缓冲液(PBS),0.15 mol/L,PH值为7.2。

2.主要仪器 美国BD公司生产的流式细胞仪,型号为FACSCalibur。

二、标本来源

26例标本取自上海长海医院门诊和病房送检的外周血标本[乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝],室温放置<6 h。其中非血液病患者标本15例(编号1~15),红细胞为(4.89±0.76)×106/μL[(3.11~5.53)×106/μL];PNH患者标本11例(编号16~26),红细胞为(2.53±0.61)×106/μL[(1.83~3.59)×106/μL]。

三、方法

1.标本处理和荧光抗体标记 将抗凝血用PBS稀释500倍后,取稀释悬液25 μL,加入荧光抗体CD55、CD59(根据荧光素组合方式,在最佳抗体量确定实验和荧光素组合模式实验中同时设CD55-FITC、CD59-PE组合和CD59-FITC、CD55-PE组合2组),涡旋混匀后室温避光温育40 min(但在温育时间试验中设9个观察时间点),然后用1 mL PBS洗涤,离心后弃去上清,加入200 μL PBS重悬,上机。另设同型对照管。

2.上机检测 每天检测前用FACSComP程序和CaliBRITETM微球对仪器进行校准和设置。然后以前向散色光/侧向散色光(FSC/SSC)对数输出模式获取20 000个红细胞,同型对照管设定阳性区域,单色标记管调节补偿,通过直方图和FL1/FL2散点图分析红细胞表面CD55、CD59的阳性率和平均荧光强度(mean fluorescence intensity, MFI)。获取和分析软件均采用CELLQuest。

四、统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。百分率采用中位数(范围)描述,MFI采用 ±s描述。阳性率分析采用秩转换的非参数检验(Friedman M检验和Wilcoxon符号秩检验),MFI分析采用单因素方差分析和配对 t检验。 P<0.05 表示差异有统计学意义。

结果
一、确定饱和红细胞表面抗原的最少用量

取非血液病标本做500倍稀释,检测每份标本在不同抗体用量下室温孵育40 min时CD59-FITC、CD55-PE和CD59-PE、CD55-FITC的MFI。CD59-FITC和CD55-PE在6种抗体量下MFI的差异有统计学意义,且随着抗体的用量增加而增加。但这种增加趋势在9 μL之后不明显(<10%),见 表1。采用CD59-PE和CD55-FITC的抗体组合,也得到了类似的结果。

表1 不同抗体量反应下CD55、CD59的MFI( ±s,道数)
二、2种荧光素组合模式下检测红细胞CD55、CD59

取非血液病标本同时以CD55-FITC、CD59-PE组合和CD59-FITC、CD55-PE组合2种模式温育40 min,测定各自的阳性率和MFI,结果见 表2。CD55-FITC的阳性率和MFI均明显低于CD55-PE( P<0.05);CD59的2种荧光素标记(FITC和PE)的阳性率间差异无统计学意义,但在MFI方面前者明显高于后者( P<0.01)。

表2 2种荧光素组合模式下测定CD55、CD59的结果
三、温育时间对红细胞CD59-FITC、CD55-PE双色荧光标记结果的影响

对2组标本稀释后采用CD59-FITC、CD55-PE双色标记,设9个抗体温育时间点(20、40、60、80、100、120、140、160和180 min),统计各时间点2个指标的阳性率和MFI。非血液病组和PNH组在3 h的抗体温育时间内,CD59-FITC阳性率差异均无统计学意义( P>0.05),见 表2;而各时间点间的CD55-PE阳性率差异有统计学意义,整体上存在下降趋势,见 表3。从 图1和 图2的MFI反应时间看,CD59-FITC随着温育时间的增加而升高( P<0.01),其中非血液病组在40 min时的上升幅度较大;而CD55-PE在40 min时有略微上升,之后随温育时间的增加而减少,尽管PNH组各时间点之间的MFI差异无统计学意义,而非血液病组差异有统计学意义( P<0.01)。另外可发现同型对照的 各时间点间无差异,见 表4。

表3 CD59-FITC在各温育时间点的阳性率[中位数(范围),%]
表4 CD55-PE在各温育时间点的的阳性率[中位数(范围),%]

图1 CD59-FITC的在3 h内变化趋势

图2 CD55-PE的在3 h内变化趋势

综合抗体用量、细胞用量、荧光素种类及其标记模式和温育时间,本研究中流式细胞仪测定红细胞CD55、CD59的最佳试验条件为12 μL的CD59-FITC、CD55-PE的抗体双色标记1.6×105~2.8×105个红细胞,温育40 min。

表5 同型对照的在3 h测定结果(道数, ±s)
讨论

CD55、CD59是通过GPI锚定作用固定在细胞膜上的补体调节蛋白。他们分别通过抑制补体C3转化酶和膜攻击复合物的形成来保护细胞不发生补体介导的溶解反应。红细胞膜CD55、CD59的表达缺陷,使红细胞对补体的敏感性增加,从而加速红细胞破坏,导致血管内溶血,这也成为PNH的重要发病机制和诊断指标之一。早在1985年就有人利用流式细胞仪和抗锚蛋白抗体来分析PNH患者外周血标本[ 1],后来Vander Schoot、Hall、Gupta等[ 2~ 4]相继通过试验提出或证明了利用单克隆抗体的流式细胞术(FCM)在PNH的实验室诊断检测中的优越性。由于FCM提供了一个可定量、特异的、高敏感的检测手段,在当今已取代了酸化血清溶血试验(Ham's试验),成为确定PNH缺陷的特异性诊断检测基础[ 5]。

对红细胞进行抗体标记是FCM检测的基础步骤,也是保证检测结果准确可靠、具有可比性的关键。这个过程涉及到荧光抗体用量、抗体选择、抗体温育时间等多个因素。当前流式检测面临试剂贵、成本高的状况,很多实验者会对试剂和反应细胞数做一定的减量处理。在细胞表面抗原未被完全饱和的情况下,MFI会随着抗体用量的增加而增加。因此,确定抗体的最佳用量就显得至关重要,这也是流式标记的第一步。我们的实验表明随着抗体用量的增加,MFI会逐渐增强,这种表现在抗体量低于12 μL时,尤为明显。当抗体量>9 μL时,MFI仅轻微升高(<10%),我们认为这种增加是由于抗体非特异结合因素的影响,因此,采用12 μL的CD59-FITC或CD55-PE试剂,标记1.6×105~2.8×105个红细胞既满足了抗原充分反应的需要,又降低了试剂的成本。采用CD59-PE和CD55-FITC的抗体组合,也得到了类似的结果。

目前,国内外研究者采用的标记模式无论在组合上还是在荧光素选择上还无统一,有的采用单色标记[ 3, 4],也有的采用双色标记且荧光素种类也不同[ 6, 7]。由于PIG-A基因突变导致了GPI锚蛋白家族缺陷,所以只有2种及以上GPI相关抗原同时异常时才可以诊断PNH,避免某些蛋白遗传性缺失[ 8]。因此,我们建议采用可确定CD55、CD59是否同时缺陷的双色标记模式。在选择荧光素的种类方面,尽管CD59 的2种荧光素FTIC和PE标记的阳性率之间无差异,但前者的MFI明显高于后者,这也就提示我们如果分析CD59荧光强度时,选择FITC标记在强弱区分上则更有优势,有利于Ⅱ型PNH细胞的分析;而CD55的结果显示无论在阳性率还是在MFI方面PE比FITC更适合流式细胞仪分析。从抗原分布密度的角度来看,红细胞膜上CD55的抗原密度低于CD59[ 3],因此选择荧光强度强的PE来标记表达密度较低的CD55抗体、荧光强度较弱的FITC来标记CD59抗体的标记模式是一组合理的抗体选择。

在探讨影响红细胞CD55、CD59检测结果的因素时,抗体孵育时间是个不可忽视的因素。温育时间较短会使抗原抗体反应不充分,导致结果偏低,出现假阴性;若是温育时间过长,则可能导致非特异结合增高,出现假阳性。目前流式表面抗原标记时间普遍采取15~20 min。但对抗体孵育3 h内分析发现,反应时间对CD55-PE阳性率、CD59-FITC和CD55-PE的平均荧光强度均有明显影响,常用的温育时间并不能使抗原抗体充分结合。另外,过度延长温育时间并不一定会使阳性率或MFI升高,CD55-PE却出现了下降的趋势,其中的原因目前尚不清楚,推测可能与CD55的表面变化(分子运动或者分子丢失等)相关。为了排除抗体非特异结合引起的这些变化,对本次实验的同型对照组也进行分析,未发现时间的影响。综合CD55和CD59的荧光强度变化趋势,我们提出40 min是一个合理的时间,既能保证红细胞充分结合抗体,又能最小的避免孵育时间对CD55、CD59变化的影响,同时又能满足检验相对快速的要求。PNH缺陷红细胞的分型[ 3, 4]是建立在掌握正常人红细胞CD55、CD59分布的基础上,若没有注意到CD55、CD59这种时间变化趋势,或未能够严格固定抗体温育时间,则会严重影响检测结果,特别是MFI,影响异常克隆较少的检出,进而导致室内检测结果变异性增大,更谈不上室间可比性。这种时间趋势也提示我们,当研究正常红细胞CD55、CD59分布而进行大量健康标本的检测时,要严格规范抗体温育时间,合理安排实验,尽可能降低室内变异性,减少偶然误差,提供一个可靠的正常参考范围。

虽然研究者对CD55、CD59做了大量的研究工作,但实验条件却各有不同。有的是利用带有荧光校准微球的诊断型试剂对20 μL 稀释全血(1∶150)的红细胞CD55或CD59进行10 min温育分析[ 9, 10],也有的为了同时分析红细胞和白细胞选择3 μL全血、10 μL抗体和30 min温育时间来获得较低的检测变异系数[ 11];在标记和荧光组合模式上有选择FITC或PE单色测定[ 4, 9, 10],也有选择CD55-FITC、CD59-PE[ 6, 12]或CD59-FITC、CD55-PE[ 7, 13]双色测定。另外加上抗体商品本身的因素影响,红细胞CD55、CD59流式细胞仪检测至今在标本处理、抗体选择乃至正常参考范围方面还无统一标准。本实验室通过优化抗体的选择、温育时间和抗体用量等几个方面对红细胞CD55、CD59检测的实验室步骤的标准化进行了初步的探索,形成了自己的标准化步骤,有效的保证了检验结果的稳定性。从我们近几年的检测结果分析,CD55、CD59检测的敏感性和特异性均很高,为临床PNH等疾病提供了有效的辅助诊断。同时我们也看到由于CD55、CD59检测的影响因素很多,各个实验室在开展这个项目时,必须对实验步骤进行严格的标准化及优化才能保证获得稳定可靠的结果。

The authors have declared that no competing interests exist.

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