引用本文
董晓微, 胡朝军, 张道强, 李丽君, 张蜀澜, 董晓娟, 李永哲. 抗核抗体与特异性自身抗体检测结果不一致的临床意义分析. 2011, 26(9): 606-609
DONG Xiaowei, HU Chaojun, ZHANG Daoqiang, LI Lijun, ZHANG Shulan, DONG Xiaojuan, LI Yongzhe. The clinical significance on the inconsistent results of antinuclear antibody and specific auto antibody determinations. Labratory Medicine, 2011, 26(9): 606-609  
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抗核抗体与特异性自身抗体检测结果不一致的临床意义分析
董晓微1, 胡朝军2, 张道强3, 李丽君2, 张蜀澜2, 董晓娟2, 李永哲2
1. 宁夏回族自治区人民医院,宁夏 银川 750021
2. 北京协和医院,北京 10032
3. 威海市文登中心医院,山东 文登 264400

通讯作者：李永哲,联系电话：010-88068795。

作者简介：董晓微,女,1969年生,学士,副主任技师,主要从事自身免疫性疾病实验室诊断研究。

基金:国家自然科学基金资助项目(30471617,30640084,30872331); 国家“十一五”科技支撑计划(2008BAI59B02,2008BAI59B03); 北京协和医院青年基金(I101430); 威海市科技发展计划资助项目(2008093-8);
摘要
目的

比较间接免疫荧光法(IIF)筛查抗核抗体(ANA)与线性免疫印迹法(LIA)检测抗核抗体谱(ANAs)特异性抗体结果不一致性,分析二者的相互关系及临床意义。

方法

采用IIF筛查ANA和LIA检测ANAs特异性抗体,将IIF-ANA阳性/LIA-ANAs阴性和IIF-ANA阴性/LIA-ANAs阳性患者分为自身免疫性疾病(AID)组和非AID组进行比较分析。

结果

216例IIF-ANA阴性AID组中, LIA-ANAs阳性率为46.30%,高于非AID组(20.00%,P=0.00);AID组LIA-ANAs (+)、LIA-ANAs (±)的比率均高于非AID组(P<0.05)。IIF-ANA阴性、LIA-ANAs阳性中,抗Ro-52、抗SSA、抗双链DNA(dsDNA)、抗线粒体抗体M2亚型(AMA-M2)、抗Sm、 抗SSB、抗核糖核蛋白(nRNP-Sm)和抗组氨酰tRNA合成酶抗体(Jo-1)为主要阳性自身抗体;AID组及非AID组IIF-ANA阳性者荧光滴度分布均以1∶801∶160为主,2组的阳性率差异无统计学意义(P>0.05);而荧光滴度为≥1∶1 280时,2组间的差异有统计学意义(P<0.05);AID组中IIF(+)、LIA(-)的荧光模式以细胞核均质型(H)为主,与非AID组比较,差异有统计学意义(P<0.01);而非AID组的荧光模式以细胞核斑点型(S)为主,与AID组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

结论

在AID的临床诊断中,除进行IIF筛查ANA外,还需根据具体情况进行特异性自身抗体的检测,避免单一方法检测导致AID患者的漏诊。

关键词: 抗核抗体; 线性免疫印迹法; 间接荧光免疫法
中图分类号:R392.11 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)09-0606-04
The clinical significance on the inconsistent results of antinuclear antibody and specific auto antibody determinations
DONG Xiaowei1, HU Chaojun2, ZHANG Daoqiang3, LI Lijun2, ZHANG Shulan2, DONG Xiaojuan2, LI Yongzhe2
1. People's Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region,Ningxia Yinchuan 750021,China
2. Peking Union Medical College Hospital, Beijing 100032, China
3. Weihai Wendeng Central Hospital,Shandong Weihai 264400, China
Abstract
Objective

To compare the inconsistent results of the indirect immunofluorescence (IIF) assay screening for antinuclear antibody(ANA) and linear immunoblot assay(LIA) for antinuclear antibody spectrum (ANAs) specific antibody, and evaluate the relationship and clinical significance.

Methods

The samples were determined for ANA screening by IIF and for ANAs by LIA. The patients with the results of IIF-ANA+ and LIA-ANAs- and IIF-ANA- and LIA-ANAs+ were classified into autoimmune disease (AID) group and non-AID group.

Results

In the 216 cases with IIF-ANA- of AID group,The LIA-ANAs+ rate was 46.30%, and the positive rate was higher than that of non-AID group (20.00%,P=0.00). The ratios of LIA-ANAs(+) and LIA-ANAs(±) of AID group were higher than those of non-AID group(P<0.05). In IIF-ANA- and LIA-ANAs+ group, the main positive autoantibodies included anti-Ro-52, anti-SSA, anti-double-stranded DNA(dsDNA), anti-mitochondrial antibody M2 subtype(AMA-M2), anti-Sm, anti-SSB, anti-nuclear ribonucleoprotein (nRNP-Sm) and anti-histidyl-tRNA synthetase antibodies(anti-Jo-1). In the cases of AID group and non-AID group, the fluorescence titers of IIF-ANA+ were 1∶80-1∶160, which was no significant difference between the AID and non-AID groups(P>0.05). However, when the fluorescence titer was ≥1∶1 280, the difference between 2 groups was statistically significant (P<0.05). In the AID group, the main fluorescence mode of IIF(+) and LIA(-) was homogeneous pattern(H), and the difference was statistically significant compared with non-AID group (P<0.01). The main fluorescence mode of non-AID group was nuclear spot pattern(S), and the difference was not statistically significant compared with AID group (P>0.05).

Conclusions

In the diagnosis of AID,besides the screening determination by IIF, it is necessary to detect the specific auto antibodies in AID patients in order to avoid the missed detection of AID.

Keyword: Antinuclear antibody; Linear immunoblot assay; Indirect immunofluorescence assay

抗核抗体(ANA)检测在临床上是一个重要的筛选试验,ANA阳性强烈提示自身免疫性疾病(AID)的可能,ANA检测对AID的诊断和鉴别具有重要意义。目前,除了用“金标准”间接免疫荧光法(IIF)检测ANA外[ 1], 另外一些检测特异性自身抗体的方法也不断应用于临床,如酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫扩散、免疫印迹、悬浮微阵列及抗原芯片等[ 24] 。国内外许多实验室常先进行ANA检测,只有ANA结果阳性时再进行特异性自身抗体谱检测[ 5, 6],有的只进行特异性自身抗体谱检测而不检测ANA。但在实际工作中IIF检测(ANA)的结果与特异性自身抗体检测结果常不完全符合。我们对2 407例临床就诊患者血清标本同时采用IIF检测ANA,用线性免疫印迹法(LIA)检测15种特异性自身抗体,比较2种检测方法结果不一致的情况,并探讨ANA检测结果与特异性自身抗体谱检测结果之间的相关性及临床意义。

材料和方法
一、对象

2009年5月至2010年6月就诊于北京协和医院申请自身抗体谱检测的患者标本共计2 407例,所有标本同时采用IIF检测ANA和LIA检测15种自身抗体。其中IIF-ANA筛查与特异性自身抗体检测结果不一致标本1 165例,包括确诊AID患者794例;确诊为其他疾病的非AID患者371例;男213例,年龄779岁;女952例,年龄1084岁。所有AID患者的诊断均符合国际相关学会的诊疗指南。送检标本均为待检测患者清晨空腹静脉血,离心分离血清。

二、方法

1. IIF检测ANA 采用德国欧蒙公司提供的ANA(马赛克)IIF试剂盒,以人喉癌上皮细胞(Hep-2)抗原片IIF检测患者血清ANA。血清稀释后与抗原基质片反应30 min(同时设阳性和阴性对照),浸泡5 min,加入荧光标记的二抗避光孵育30 min,浸泡5 min,加甘油封片后荧光显微镜下判读结果,以抗体滴度≥1∶80为阳性。

2. LIA检测抗核抗体谱(ANAs) 采用德国欧蒙公司提供的LIA,检测项目包括以下15种特异性自身抗体:抗核糖核蛋白(nRNP/Sm)、抗Sm、抗SSA、抗Ro-52、抗SSB、抗Scl-70、抗PM-Scl、抗组氨酰tRNA合成酶抗体(Jo-1)、抗着丝点蛋白B(CENP B)、抗增殖细胞核抗原(PCNA)、抗双链DNA(dsDNA)、抗核小体、抗组蛋白、抗核糖体(rRNP)、抗线粒体抗体-M2型 (AMA-M2)。在第1次温育时,经1∶100稀释的患者血清1.5 mL与膜条上的靶抗原反应30 min,然后洗涤3次(5 min/次),加入1.5 mL酶标记的抗人IgG(酶结合物)反应30 min,洗涤3次(5 min/次)后加入底物液反应15 min,最后以蒸馏水清洗膜条以终止反应,并采用配套软件EUROLineScan进行结果扫描,系统自动判读出各条带的显色灰度值,灰度值≤5为LIA阴性(-);610为LIA临界(±);≥11为LIA阳性(+)。同一膜条上有多个靶抗原阳性,则以灰度值高的为最终阳性强度结果。

三、统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析。率的比较采用 χ2检验和Fisher确切概率法, P<0.05表示差异有统计学意义。

结果
一、LIA检测IIF-ANA阴性者15种自身抗体结果分析

794例确诊AID患者组 IIF-ANA阴性216例, 371例非AID患者组中IIF-ANA阴性225例, AID组中IIF-ANA阴性、LIA-ANAs阳性为100例,占46.30%,高于非AID组(20.00%),差异有统计学意义( P=0.00);其中LIA-ANAs阳性结果按灰度值分为LIA(+)、LIA(±),AID组LIA(+)、LIA(±)的比率均高于非AID组( P<0.05),见 表1。

表1 AID组及非AID组IIF-ANA阴性者的LIA-ANAs结果分析(%)
二、AID组及非AID组中IIF(-)、LIA(+)者15种自身抗体检测结果

IIF(-)、LIA(+)包括IIF(-)、LIA(+)与IIF(-)、LIA(±)。 IIF(-)、LIA(+)组中抗Ro-52、抗SSA、抗Sm、抗nRNP/Sm和抗SSB抗体为主要阳性自身抗体,阳性率为 9.66%37.93%,而抗dsDNA和抗rRNP抗体的阳性率分别为6.90% 和3.45%,见 表2。

表2 AID组及非AID组中IIF(-)、LIA(+)者15种自身抗体检测结果
三、AID组及非AID组IIF(+)、LIA(-)者荧光滴度分析

AID组及非AID组IIF(+)、LIA(-)者的荧光滴度分布均以1∶801∶160为主,其阳性率分别为45.90%和46.27%,2组的阳性率差异无统计学意义( P>0.05);而AID组荧光滴度≥1∶1 280占22.13%,高于非AID组的10.45%,差异有统计学意义( P<0.05);而1∶3201∶640在2组中的阳性率差异无统计学意义( P>0.05),见 表3。

表3 AID组及非AID组IIF(+)、LIA(-)者荧光滴度分析
四、AID组及非AID组IIF(+)、LIA(-)者荧光模式分析

AID组中IIF(+)、LIA(-)者的荧光模式以细胞核均质型(H)为主,占51.64%,明显高于非AID组( P<0.01);而非AID组的荧光模式以细胞核斑点型(S)为主,占34.33%, AID组S型占27.05%,二者差异无统计学意义( P>0.05),见 表4。

表4 AID组及非AID组IIF(+)、LIA(-)者荧光模式分析
讨论

血清ANA是临床AID诊断中重要的自身抗体。以Hep-2为抗原底物的IIF被认为是筛查自身抗体的有效方法。免疫荧光染色模型有助于相关自身抗原的确认,对临床有重要提示。但ANA的筛查对AID诊断没有特异性,而且大多数AID患者的血清用IIF检测可见多种荧光染色模型的重叠,可能误导临床诊断。随着研究的不断深入,发现并确认了许多特异性自身抗体,其相应靶抗原的纯化技术不断提高,这些特异性自身抗体对应的自动化程度较高、易于标准化的检测方法不断涌现,如ELISA、LIA、化学发光法以及液相芯片技术等,其中LIA操作简便快速、易自动化,结果判读方便,一次可检测AID相关的多种特异性自身抗体,并且在方法学上与ELISA比较有相似的敏感性和特异性[ 7]。在临床检测中,我们发现IIF检测ANA与LIA检测特异性自身抗体结果不完全符合。本研究对ANA的IIF检测结果与特异性自身抗体的LIA检测结果不一致的标本进行比较分析,明确二者的相互关系及其临床意义。

本次研究结果表明794例AID患者组中 IIF-ANA阴性216例, 371例非AID患者组中IIF-ANA阴性225例,IIF-ANA阴性的AID组中LIA-ANAs阳性为100例(46.30%),高于非AID组(20.00%);其中AID组LIA-ANAs(+)、LIA- ANAs (±)的比率均高于非AID组。在IIF-ANA阴性、LIA-ANAs阳性组中存在大量AID患者,说明在IIF-ANA阴性情况下LIA- ANAs的阳性检测结果同样有重要的临床提示价值。

AID组及非AID组中IIF(-)、LIA(+)的各特异性自身抗体分析结果表明,抗Ro-52、抗SSA、抗Sm、抗nRNP-Sm和抗SSB抗体为主要阳性自身抗体。这些漏检的特异性抗体中既有对某些AID诊断敏感性较高的抗体如抗SSA和AMA-M2,又有对某些AID诊断特异性较高的抗体如抗Sm、抗Jo-1和抗Scl-70抗体。由于IIF采用的Hept-2细胞抗原底物存在分布不均[ 8]、含量过低以及不同固定方法对特定抗原的破坏等因素影响。因此,可能导致部分特异性抗体的漏检,如抗SSA抗体,此外LIA及ELISA等方法的检测敏感性也高于IIF。

目前,许多研究以IIF-ANA的1∶160滴度判断为阳性,对于AID有一定的临床诊断意义,且被大多数实验室所接受[ 9, 10]。而本研究AID组及非AID组中ANA低滴度时差异无统计学意义( P>0.05),ANA≥1∶1 280时AID组与非AID组差异有统计学意义( P<0.05),但LIA中常见的15种特异性自身抗体均为阴性,因此,不能仅进行特异性自身抗体的检测而忽略IIF-ANA筛查。IIF-ANA筛查的抗体针对细胞核中所有抗原成分,而目前检测的特异性自身抗体仅为自身抗体中的一小部分,仍有大量未知的特异性自身抗体未被认识或未应用于临床检测。

IIF检测ANA可呈现形态各异的荧光染色模型,通过对荧光模型的分析,可初步判断相应抗体的性质,从而指示进一步的特异性抗体检测。但有时同种抗体可出现不同的荧光染色模型,不同的抗体也可出现同样的荧光染色模型。因此,荧光模型具有一定的提示作用,但仅根据核型来推断抗体是片面的。

总之,IIF-ANA筛查具有覆盖ANA抗体面广的特点,而特异性自身抗体检测具有疾病特异性和较高的检测敏感性,并且2种方法学间存在检测敏感性和特异性的差异。如果单用任何一种方法检测都有可能造成ANA阳性结果的漏检、漏报或AID的漏诊。因此,临床应用时,尤其临床疑似AID的患者,需同时进行IIF-ANA筛查和各种特异性自身抗体检测。

The authors have declared that no competing interests exist.

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