引用本文
胡雷光, 朱立岳, 陈坚, 王昕蕾, 楚青. 载脂蛋白A5基因-3A/G多态性对血脂代谢及其相关疾病的关系探讨. 2011, 26(9): 593-597
HU Leiguang, ZHU Liyue, CHEN Jian, WANG Xinlei, CHU Qing. Investigation on the relationship of apolipoprotein A5 gene -3A/C polymorphism with blood lipid metabolism and relevant diseases. Labratory Medicine, 2011, 26(9): 593-597  
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载脂蛋白A5基因-3A/G多态性对血脂代谢及其相关疾病的关系探讨
胡雷光, 朱立岳, 陈坚, 王昕蕾, 楚青
上海市静安区中心医院 复旦大学附属华山医院静安分院检验科,上海 200040

通讯作者：朱立岳,联系电话：021-61578000×8271。

作者简介：胡雷光,男,1963年生,学士,副主任技师,主要从事临床检验和实验室管理工作。

基金:上海市静安区卫生系统“十、百、千”人才建设工程,学科带头人培养资助项目(200706A004);
摘要
目的

探讨载脂蛋白A5(apo A5)基因-3A/G 单核苷酸多态性(SNP)与血脂代谢及其相关疾病的关系,为临床疾病诊断和早期干预提供实验数据。

方法

收集232名体检健康的汉族人群及209例冠心病(CHD)、132例糖尿病(DM)、107例脑梗塞(CI)和199例高血压(HTN)患者的血样标本,通过DNA提取、聚合酶链反应(PCR)扩增和DNA测序,检测apo A5 基因-3A/G SNP。同时检测三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)等血脂水平,分析其相互之间的关系。

结果

AA纯合子占52.5%,AG杂合子占39.7%,GG纯合子占7.8%。A等位基因分布频率为72.4%,G等位基因的分布频率为27.6%。GG基因型与AA型、AG型人群比较,TG和非高密度脂蛋白胆固醇(non-HDL-C)水平增高(P<0.05)、HDL-C水平降低(P<0.05)。对照组与疾病组比较,TG水平在AA和AG基因型中差异有统计学意义(P<0.05);GG基因型中对照组TG水平与疾病组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

结论

apo A5 基因-3A/G SNP对血脂代谢相关疾病的调控主要表现为GG基因型与高TG、低HDL-C和高non-HDL-C显著相关,是导致脂质代谢紊乱的重要候选基因之一。

关键词: 载脂蛋白A5; 基因多态性; 血脂代谢
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)09-0593-05
Investigation on the relationship of apolipoprotein A5 gene -3A/C polymorphism with blood lipid metabolism and relevant diseases
HU Leiguang, ZHU Liyue, CHEN Jian, WANG Xinlei, CHU Qing
Department of Clinical Laboratory, Shanghai Jing'an District Central Hospital,Jing'an Branch of Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China
Abstract
Objective

To investigate the relationship of apolipoprotein A5(apoA5) gene -3A/G single nucleotide polymorphism (SNP) with blood lipid metabolism and relevant diseases, and provide the data for the clinical disease diagnosis and early intervention.

Methods

The blood samples were collected from 232 healthy Han people, 209 coronary heart disease(CHD) patients, 132 diabetes mellitus(DM) patients, 107 cerebral infarction(CI) patients and 199 hypertension (HTN) patients in Shanghai Jing'an District Central Hospital. DNA extraction, polymerase chain reaction(PCR) amplification and DNA sequencing were used to detect apoA5 gene -3A/G SNP. The biochemical analyzers were used to detect the levels of blood lipid such as triglyceride (TG), total cholesterol (TC), high density lipoprotein cholesterol (HDL-C) and low density lipoprotein cholesterol (LDL-C). Their relationship was analyzed statistically.

Results

AA homozygote,AG heterozygote and GG homozygote were 52.5%, 39.7% and 7.8% respectively. The distribution sequences of A and G alleles were 72.4% and 27.6%. Compared the healthy Han people group of GG gene type to ones of AA and AG gene types, TG raised (P<0.05), HDL-C reduced (P<0.05) and non-HDL-C (non-HDL-C) raised (P<0.05). Compared the control group to the disease group, the value of TG had statistical significance in the gene types of AA and AG (P<0.05), and the value of TG in the control group of GG gene type raised lightly with no statistical significance (P>0.05).

Conclusions

The regulation from apoA5 gene -3A/G SNP to the disease of blood lipid metabolism is mainly performed at the relationship between gene type of GG and high level of TG, low level of HDL-C and high level of non-HDL-C. This gene is one of the candidate genes which leads to the disorder of lipid metabolism.

Keyword: Apolipoprotein A5; Genetic polymorphism; Blood lipid metabolism

血脂代谢异常可发展成心血管疾病早被学术界所公认[ 1]。载脂蛋白A5(apolipoprotein A5,apo A5)基因是2001年Pennacchio等[ 2]和van-der-Vliet等[ 3]通过比较小鼠与人的基因组DNA而发现的一种新的载脂蛋白基因。apo A5基因被描述有15种单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP),其中-1464T/C、-1131T/C、56C/G、-3A/G和1259T/C SNPs与调节三酰甘油(TG)水平相关,也是心血管等疾病的一个独立的危险因子[ 4]。我们通过检测健康汉族人群apo A5 基因-3A/G SNP和血脂水平,并与冠心病(coronary heart disease,CHD)、2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)、脑梗塞(cerebral infarction,CI)、高血压(hyper tension,HTN)等患者进行比较,分析apo A5基因-3A/G的基因变异对血脂代谢及其相关疾病的作用和影响。

材料和方法
一、研究对象

标本均采集自上海市静安区中心医院2007至2009年体检者和住院患者。(1)对照组:232名(男131名,女101名),为体检人群,年龄66±5岁,经询问病史、体格检查以及心电图、动态心电图、空腹血糖、肝肾功能检查等,排除CHD、T2DM、CI、HTN 等疾病史;(2)CHD组:209例(男117例,女92例),年龄70±7岁,符合美国心脏病学会/美国心脏协会(ACC/AHA)不稳定型心绞痛和非ST段抬高心肌梗死治疗指南(2007年修订版)的诊断标准;(3)DM组:132例(男67例,女65例),年龄68±8岁,为T2DM,符合1999年世界卫生组织(WHO)国际糖尿病联合会(IDF)公布,同年得到中华医学会糖尿病学会认可的诊断标准;(4)CI组:107例(男61例,女46例),年龄64±6岁,符合1995 年中华医学会第四次全国脑血管病学术会议修订的诊断标准并经头部CT或头部MRI证实;(5)HTN组:199例(男110例,女89例),年龄67±9岁,符合2007年欧洲高血压指南诊断标准。

二、血脂检测

所有研究对象均空腹抽血5mL,置普通试管。自然凝固后离心分离血清,当日在日立7170s全自动生化仪上测定完成TG、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的检测,非高密度脂蛋白胆固醇(non-HDL-C)由TC减去HDL-C计算获得。所用的试剂均由上海申索试剂有限公司生产,测定同时使用Beckman常规化学质控品和Bio-Rad血脂控制品进行质量控制。

三、apo A5基因-3A/G检测

1. 全血DNA抽提 所有研究对象均空腹抽血2 mL,置乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管-20 ℃冻存,4周内完成抽提。抽提使用美国Axygen公司提供的AxyPrep全血基因组DNA小量提取试剂盒。使用5 mmol/L Tris-HCL 缓冲液溶解DNA,-20 ℃冻存,供聚合酶链反应(PCR)试验备用。

2. 引物合成 根据apo A5 -3A/G SNP(SNP序列号rs651821)所在基因的序列,设计用于扩增的上、下游引物。上游5'-CCT CCC TCC ACC TGT CTT CT-3';下游5'-AAC GCT GTG GAG AGG GAC TA-3',由上海生物工程技术服务有限公司合成。

3. PCR扩增 反应体积为25 μL,含DNA 0.1 μg,上、下游引物各0.05 μmol/L,400 μmol/L的各种dNTP,1.25 U Taq DNA聚合酶,3 mmol/L Mg2+和PCR缓冲液。反应条件为:94℃预变性15 min, 然后进行94℃变性30 s、57℃退火30 s、72℃延伸30 s循环,共36个循环,最后在72℃延伸60 s。PCR仪为美国AB公司生产的9700型PCR仪。每个标本完成扩增后取5 μL进行琼脂糖电泳验证,目的片段为174 bp。结果见 图1。

图1 PCR产物琼脂糖电泳

4. 测序分析 PCR产物直接测序分析。委托北京六合华大基因科技股份有限公司完成测序分析。每批测定分送1%3%的标本至上海闪晶分子生物技术研究所同时测定,供验证结果使用,结果见 图2。

图2 测序结果与结果判断

四、统计学方法

基因型频数采用百分比表示,各组基因型平衡性检验使用Hardy-Weinberg检验。血脂检测数据均以 ±s表示。其中TG数据经正态性检验为偏态分布,用中位数(范围)表示,取常用对数后将其转换成正态分布类型数据后用于统计分析。不同基因型间的血脂比较采用 t检验。在SAS 8.02统计软件包上进行分析。

结果
一、对照组与疾病组之间血脂指标比较

4种疾病组TG水平均较对照组增高( P<0.05);HDL-C水平均降低( P<0.05);non-HDL-C除HTN组外均增高( P<0.05)。CHD、CI和HTN组LDL-C水平及HTN组TC水平低于对照组( P<0.05)。结果见 表1。

表1 疾病组血脂指标的比较(mmol/L)
二、4种疾病组等位基因频率与对照组比较及Hardy-Weinberg平衡检验

通过卡方检验等位基因频率分布,CHD、DM、CI、HTN 组与对照组比较,差异均无统计学意义( P>0.05)。且各组都符合Hardy-Weinberg平衡定律( P>0.05)。见 表2。

表2 4种疾病组与对照组的等位基因频率Hardy-Weinberg平衡检验
三、apo A5 -3A/G 3种基因型中对照组与疾病组之间血脂指标的相互比较

对照组AA型与AG型人群比较各项血脂参数差异均无统计学意义( P>0.05)。GG型与AA型及AG型人群比较,TG和non-HDL-C水平增高( P<0.05)、HDL-C水平降低( P<0.05)。结果见 表3。

GG基因型4种疾病组与对照组比较,HDL-C水平均降低( P<0.05),TG水平差异均无统计学意义( P>0.05)。4种疾病组non-HDL-C水平与对照组比较,AA型仅DM组有增高,AG型均明显增高( P<0.05),GG基因型则差异无统计学意义( P>0.05)。

AA型中CI组TC水平低于对照组( P<0.05)、CHD、CI、HTN组的LDL-C水平低于对照组( P<0.05),AG型中CHD、HTN组的LDL-C水平低于对照组( P<0.05)。结果见 表3。

表3 apo A5 -3A/G 3种基因型中对照组和疾病组之间血脂指标的比较(mmol/L)
讨论

apo A5基因定位于11号染色体长臂q23区(11q23),与apo A1/C3/A4基因簇距约30 kb,彼此相互连接而共同组成一个基因家簇。apo A5基因全长1 889 bp,由4个外显子、3个内含子构成,编码366个氨基酸[ 2]。它属于apo Al/C3/A4/A5基因族,与多种载脂蛋白具有同源性,其中有49%的氨基酸与apo A4相似,24%的氨基酸完全相同。研究认为apo A5主要分布在极低密度脂蛋白(VLDL)、HDL及乳糜微粒(CM)中。因此,其与脂质特别是TG代谢的密切关系而成为近几年来国内外学者研究的热点[ 58]。

Melissa等[ 9]通过在日本的美国家庭的遗传家属史人群调查研究后,认为2个稀有等位基因 -1131T/C和 -3A/G SNPs与LDL降低和TG增高相关,其SNP出现频率高于已报道的在高加索、西班牙和非洲的美国人群,但与在日本和中国的美国人群相似,因此认为亚洲人群的-1131T/C,尤其是-3A/G SNP与LDL降低和TG增高更为密切。而近期Liu等[ 6]也报道了中国香港的家族性血脂异常与此2个基因关系密切,其变异的纯合子基因携带者产生血清中高TG和LDL以及低HDL水平。

至今为止全球已经发现了大约10余种主要的apo A5 SNPs位点。这些位点在西方人群中多数已经得到了初步的研究[ 10]。然而在国内以研究了1131T/C、56C/G(S19W)、c.12238T/C、c.553G/T SNPs等几个热门位点居多[ 8, 11]。但-3A/G与-1131T/C一样都位于基因调控区对apo A5表达及功能有影响,进而也可能影响到血TG水平。

由于不同的人群中SNP位点的频率和功能并不相同。因此,本研究综合分析目前国内外研究的热点,通过检测体检健康者和血脂代谢等相关疾病患者的apo A5基因-3A/G SNP的分布频率与TG、TC、HDL-C和LDL-C等生化指标及临床诊断进行统计比较分析,探讨该基因位点在上海地区汉族人群中的分布和功能及其各基因型对血脂代谢和相关疾病的作用和影响。

本研究对照组的结果显示,-3A/G SNPs的G等位基因频率为27.6%,显著高于Ruiz-Narváez等[ 12]在白种人(14%)和Liu等[ 6]在香港人群(19%)中报道的频率。而GG基因型与AG和AA基因型比较,TG、non-HDL-C水平显著增高,HDL-C水平明显降低( P<0.05)。non-HDL-C被认为是主要代表了血清中的VLDL。因此可认为GG基因型与高TG、低HDL-C和高VLDL-C密切相关。前两者结果与Liu等[ 6]和Melissa等[ 9]的报道基本相符,是导致脂质代谢紊乱及相关疾病易感的重要候选基因之一。

apo A5 -3A/G 3种基因型在疾病组与对照组的结果比较中显示,GG基因型的TG水平差异无统计学意义( P>0.05),显示疾病组TG增高与对照组相似,说明GG基因型也可能是引起4种相关疾病人群TG增高的主要原因。而另外2种基因型TG增高的现象与此不同,表现为疾病组TG水平均高于对照组( P<0.05)。因此我们分析认为由于血清TG浓度受多基因调节控制,疾病组中AA和AG基因型TG水平增高可能是以受到其他基因调控的结果为主。其次,3种基因型的疾病组HDL-C水平均低于对照组( P<0.05),未显示GG基因型的疾病组HDL-C水平降低与对照组相似,Endo 等[ 13]报道apo A5 抗体与HDL-C 有交叉反应,认为是HDL-C的构成成分,应受到apo A5基因的作用,但本研究结果未表示-3A/G基因对疾病组的HDL-C有明显的调控作用,因而可能存在其他基因的控制因素。

通过Hardy-Weinberg平衡性检验和卡方检验,我们未发现4种疾病组等位基因频率不符合平衡定律( P>0.05),同时尚不能确定apo A5 -3A/G基因是导致上海汉族人群罹患CI、CHD、DM和HTN的直接因素,有待于进一步的研究。

综合分析apo A5 -3A/G SNPs对4种与血脂代谢和相关疾病的影响,发现GG基因型是导致CI、CHD、DM和HTN患者TG增高的一个重要因素。分析本研究中apo A5 -3A/G基因型的调控结果与国外的报道有差异的方面,可能的原因有2个。一是虽然GG型基因对血脂代谢调控的情况相似,但由于遗传背景、种族关系及地域差异使上海地区的汉族人群基因分布频率不同;二是考虑样本数量可能不够大,应该存在的差异没有显露出来。

The authors have declared that no competing interests exist.

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