引用本文
李云春, 邹广珠, 钟丽民, 周丽萍, 程伟志, 钟利. P53上游凋亡调节蛋白在依托泊苷诱导直肠癌细胞凋亡中作用机制的研究. 2011, 26(6): 390-393
LI Yunchun, ZOU Guangzhu, ZHONG Limin, ZHOU Liping, CHENG Weizhi, ZHONG Li. ResearchonthemechanismofPUMAwithetoposidecellapoptosisinhumancolorectaltumor. Labratory Medicine, 2011, 26(6): 390-393  
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P53上游凋亡调节蛋白在依托泊苷诱导直肠癌细胞凋亡中作用机制的研究
李云春1, 邹广珠1, 钟丽民1, 周丽萍1, 程伟志1, 钟利2
1. 上海市长宁区光华中西医结合医院,上海 200052
2. 宁夏医科大学附属医院,宁夏银川 750004

作者简介：李云春,女,1967年生,硕士,副主任技师,主要从事临床免疫学检验工作。

摘要
目的

研究P53上游凋亡调节蛋白(PUMA)在直肠癌细胞HCT116中的表达及其关联性作用机制。

方法

应用依托泊苷诱导直肠癌细胞HCT116,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)、流式细胞仪测定依托泊苷作用前后细胞HCT116的凋亡情况;蛋白印迹法(Western blot)测定PUMA、P53蛋白的表达水平。

结果

依托泊苷可抑制直肠癌细胞HCT116生长,并呈时效和量效关系;依托泊苷作用前后PUMA、P53蛋白表达水平逐渐升高。

结论

依托泊苷通过恢复P53的功能增加PUMA的表达,诱导肿瘤细胞调亡,起到抑制肿瘤生长的作用。

关键词: 凋亡; 依托泊苷; P53上游凋亡调节蛋白; 肿瘤
中图分类号:R446.62 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)06-0390-04
ResearchonthemechanismofPUMAwithetoposidecellapoptosisinhumancolorectaltumor
LI Yunchun1, ZOU Guangzhu1, ZHONG Limin1, ZHOU Liping1, CHENG Weizhi1, ZHONG Li2
1.ShanghaiChangningGuanghuaHospitalofIntegratedTraditionalandWesternMedicine,Shanghai 200052,China
2.AffiliatedHospitalofNingxiaMedicalUniversity,NingxiaYinchuan 750004,China
Abstract
Objective

To study the expression and related mechanism of P53 up-regulated modulator of apoptosis(PUMA) with cell apoptosis in human colorectal tumor cell line HCT116.

Methods

The HCT116 were induced with etoposide. The apoptosis of HCT116 was determined by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) and flow cytometry. The expressions of PUMA and P53 protein were determined by Western blot.

Results

Etoposide inhibited the proliferation of HCT116 in time- and dose - independent manners.The expression level of the PUMA and P53 protein increased gradually.

Conclusions

Etoposide can induce the apoptosis of HCT116 and kill the tumor cells by the expressions of PUMA and P53 protein.

Keyword: Apoptosis; Etoposide; P53 up-regulated modulator of apoptosis; Tumor

直肠癌是一种常见的、严重危害人类健康的恶性肿瘤,其发病率和死亡率呈逐年上升的趋势,直肠癌的发生过程是一个多阶段、多基因改变的过程。细胞凋亡在胚胎发育、维持组织自稳态等方面起重要作用。近年来研究表明,大肠肿瘤的发生与细胞凋亡过程被抑制有关。P53上游凋亡调节蛋白(P53 up-regulated modulator of apoptosis,PUMA)是近年发现的、具有强大促凋亡作用和细胞生长抑制作用的蛋白,其基因位于p53基因的下游[ 1~ 3]。本研究采用酶联免疫吸附试验(ELISA)、流式细胞术及蛋白印迹法(Western blot)测定直肠癌细胞HCT116凋亡率及PUMA的表达水平,以探讨PUMA在直肠癌的发生、发展中的作用及其与细胞凋亡的相关性,深入阐明直肠癌发病的分子机制。

材料和方法
一、材料

1. 细胞及其培养 直肠癌细胞HCT116(购自中科院细胞库)采用含10%小牛血清、青霉素(100 U/L)、链霉素(100 mg/L)的达尔伯克必需基本培养基(dulbecco's minimum essencial medium, DMEM,美国Sigma 公司),在含5%CO2、37 ℃饱和湿度的培养箱中培养, 0.25%胰蛋白酶消化传代。

2. 药物和试剂 依托泊苷购于美国Sigma 公司,用生理盐水配成1 mg/mL的储存液;M30-ApoptosisTM-kits 购于瑞典PEVIVA AB,Bromma 公司;鼠抗人PUMA(1∶1 000)、抗P53(1∶1 000)和抗细胞骨架蛋白(β-tubulin)抗体(1∶500)均为美国Sigma Aldrich 公司产品。

二、方法

1. 噻唑蓝(MTT)试验 细胞HCT116经胰酶消化后计数,调整细胞密度为4×104 /mL,接种于96 孔板,每孔100 μL。分设对照组和不同浓度药物组(2.5、5.0、10.0 和15.0 μmol/L),每孔设2复孔,分别培养0、12、24、48和72 h;每孔加入200 μL 二甲基亚砜(DMSO)终止,振荡15 min, 450 型ELISA-Reader 酶标仪(Bio-Rad 公司) 570 nm 主波长、630 nm 副波长检测吸光度( A)值。以对照组细胞活力为100%,按公式:细胞抑制率=1-(药物组 A值/对照组 A值)×100%计算各组细胞存活率。

2. M30-ApoptosisTM-kits 分析凋亡率[ 4] 细胞HCT116经胰酶消化后计数,调整细胞密度为104 /mL,接种于96 孔板,每孔100 μL。分设对照组和不同浓度药物组(2.5、5.0、10.0 和15.0 μmol/L),每孔设2复孔,经多次试验后发现5.0 μmol/L药物浓度对细胞HCT116凋亡抑制较好,选择5.0 μmol/L药物组作为试验组,分别培养0、12、24、48和72 h;每孔加入200 μL DMSO 终止,振荡15 min,使用M30-ApoptosisTM-kits 试剂盒(严格按说明书操作)、450 型ELISA- Reader 酶标仪(Bio-Rad 公司)450 nm检测各组 A值。

3. 流式细胞仪分析凋亡率[ 5] 将细胞 HCT116 接种于六孔板,待细胞长至75%融合左右,加入5.0 μmol/L的依托泊苷,分别作用0、12、24、48 和72 h 后,胰酶消化收集细胞,磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后, 80%冰乙醇固定, -20 ℃过夜。检测前PBS 冲洗细胞1 次,调整细胞浓度为4×106 /mL,加入含RNase A(终浓度为0.25 mg/mL)的碘化丙啶(PI)染色液(终浓度50 μmol/L)中,室温避光染色30 min,流式细胞仪(购自Bechman Dickson 公司)检测,每组重复3 次,CellQuest 及Motift 软件分析亚G1 峰。

4. Western blot 将细胞 HCT116 接种于六孔板,待细胞长至75%融合左右,加入依托泊苷(5.0 μmol/L),分别作用0、12、24、48 和72 h 后,胰酶消化收集细胞, PBS 洗涤后收集细胞,加入细胞裂解液,于冰上放置15 min,以12 000 r/min(离心半径5 cm)离心15 min,取上清液,紫外分光光度计定量后置-80 ℃备用。灌制10% 聚丙烯酰胺凝胶,常规电泳,转膜,封闭,抗体浓度为(1∶1 000),4 ℃孵育过夜,室温孵育2 h, Fuji显影仪显色,读取结果;β-tubulin作为内对照。

三、统计学方法

采用SPSS 10.0 软件进行分析,计量资料用 x- ±s表示,进行方差分析和 t检验,率的比较应用 χ2检验,以 P<0.05为差异有统计学意义。

结 果
一、药物作用动力学

细胞存活率试验显示,在本试验所采用的不同药物浓度下依托泊苷均能抑制直肠癌细胞HCT116的生长。药物作用效果具有一定的时效和量效关系。经多次试验后发现5.0 μmol/L药物浓度对细胞HCT116 凋亡抑制较好,选择5.0 μmol/L药物组作为试验组,选择5.0 μmol/L的依托泊苷浓度作为试验用量。方差分析结果显示,不同药物浓度结果差异有统计学意义( F=136.1, P=0.000);不同时间结果差异有统计学意义( F=1 230.38, P=0.000),见 表1。

表1 不同时间依托泊苷抑制细胞HCT116生长结果的比较( A值)
二、M30-ApoptosisTM-kits分析凋亡率

在肿瘤细胞的凋亡过程中,半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶激活是整个凋亡过程的核心环节和关键步骤。凋亡蛋白酶家族的促凋亡蛋白酶被激活并可切断各种不同的细胞内物质, M30-ApoptosisTM-kits 中的M30抗体可特异性识别细胞胞质角蛋白(CK18)的Asp237-Asp396 断裂位点,通过检测CK18-Asp237-Asp396片段含量可反映诱导调亡的情况。依托泊苷诱导细胞HCT116凋亡具有时间及剂量依赖性,不同浓度依托泊苷在不同的时间点可诱导不同的肿瘤细胞凋亡率,依托泊苷作用24 h可诱导较高的细胞凋亡率,见 表2。

表2 不同时间依托泊苷诱导细胞HCT116释放CK18-Asp237-Asp396含量的比较(U/L)
三、流式细胞仪检测细胞凋亡率

5.0 μmol/L依托泊苷作用于细胞HCT116 0、12、24、48和72 h,通过亚G1 峰检测其凋亡率分别为(1.78±1.36)%、(3.29±2.56)%、(56.34±6.21)%、(48.76±5.68)%和(41.71±7.34)%,其中依托泊苷作用24、48及72 h细胞凋亡率与对照组比较,差异具有统计学意义。( χ2=6.007、13.740、11.881, P=0.010、0.003、0.000)。

四、Western blot 检测结果

5.0 μmol/L依托泊苷作用于细胞HCT116 12、24、48和72 h与0 h比较, PUMA、P53蛋白的表达逐渐增加(PUMA t=-9.69、-8.76、-14.32、-15.24, P=0.000、0.001、0.000、0.000; P53蛋白 t=9.72、-2.67、6.99、3.78, P=0.000、0.007、0.000、0.011),见图1。

图1 依托泊苷诱导细胞HCT116凋亡过程中蛋白水平的变化

讨 论

细胞凋亡是一种非常复杂的生理和病理过程,是细胞主动参与的“自杀”机制。化疗药物引起癌细胞凋亡的过程相当复杂,不同的通路互相渗透、互相影响,不同的蛋白、因子或基因互相作用、互相制约,既往普遍认为化疗药物杀灭肿瘤细胞的机制是其基因组毒性导致DNA 异常,不能维持复制功能。近来这种认识有所深入,无论药物的靶点何在,多种化疗药物最终是通过诱导凋亡或肿瘤坏死而达到治疗目的[ 6, 7]。化疗药物诱导癌细胞凋亡常见途径大体上可分为内源性及外源性2种,二者共同结果是半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶激活,都是半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶依赖性途径。凋亡蛋白酶家族的促凋亡蛋白酶被激活并可切断各种不同的细胞内物质,其中包括CK18,M30-ApoptosisTM-kits 中的M30抗体可特异性的识别CK18的Asp237-Asp396 位点,通过检测CK18-Asp237-Asp396片段含量可反映依托泊苷诱导调亡的情况。本研究发现依托泊苷诱导细胞HCT116凋亡具有时间及剂量依赖性,作用24 h可诱导较高的细胞凋亡率,与文献研究结果一致[ 6, 7]。提示肿瘤细胞对化疗药的敏感性与化疗药物量的大小及用药时间有关,CK18-Asp237-Asp396片段含量测定可望成为肿瘤治疗的临床效果及过度治疗的观察指标。

PUMA 属于凋亡蛋白Bcl-2家族BH-3亚家族中的成员,具有强大的促凋亡作用和细胞生长抑制作用。PUMA可以通过P53依赖性以及P53非依赖性2条途径促进细胞凋亡[ 1, 2]。在本研究中,PUMA和P53表达有明显的相关性,随作用时间的增加,他们的表达逐渐加强,说明PUMA在直肠癌内通过P53依赖内源性途径发挥作用,如果P53变异后将丧失对PUMA的正向调节作用,致使PUMA表达缺失。本研究表明,直肠癌细胞中的PUMA凋亡调节作用可能是通过P53-PUMA途径实现的。

p53基因位于第17号染色体17p13上,长度为16~20 kb,含有11个外显子和10个内含子,编码蛋白为53 000的核蛋白。一般认为P53 是转录因子,能诱导促凋亡基因(Bax、Bid、Bim、Noxa 和Puma)、细胞周期进程的抑制剂(p21)、氧化应激和内质网应激的介导子、死亡受体信号通路的组分和半胱氨酸天门冬氨酸蛋白激活因子等的表达。P53 还可直接作用于Bax、Bak、Bcl-2 和Bcl-XL,诱导线粒体外膜通透性增加,PUMA 和p21 在P53 诱导的凋亡通路中发挥关键作用[ 8, 9]。Western blot观察到P53 蛋白表达增加,诱导PUMA表达增加,证实了依托泊苷对直肠癌细胞HCT116 抗癌作用是通过恢复P53 的功能实现的。细胞存活率试验显示,依托泊苷可显著抑制直肠癌细胞HCT116的生长,其作用具有一定的时效和量效关系。流式细胞仪检测结果和M30-ApoptosisTM-kits分析凋亡率结果表明,依托泊苷对直肠癌细胞HCT116 的生长抑制作用主要是通过凋亡而实现的。

许多肿瘤组织存在PUMA低表达,其低表达水平与肿瘤的发生、发展有关,而增加肿瘤细胞PUMA表达可明显抑制肿瘤生长,并能增强肿瘤细胞对放疗和化疗的敏感性[ 10]。但要使其成为可能,一方面需要明确PUMA的作用通路,阐明他与其他相关基因相互作用的机制,另一方面需要寻找到能导致PUMA激活的元件、转录因子及其他无毒性的小分子物质,这样就可以利用这些物质激活在肿瘤细胞内表达,达到治疗的目的。相信随着对结直肠癌凋亡机制的阐明将有利于发展靶向于凋亡的治疗策略。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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