引用本文
杜玉珍, 张海晨, 李莉, 高锋. 外周血STC-1mRNA测定及其在结直肠癌诊断中的价值. 2011, 26(6): 387-389
DU Yuzhen, ZHANG Haichen, LI Li, GAO Feng. Expressionanditssignificanceofstanniocalcin-1mRNAintheperipheralbloodofpatientswithcolorectalcancer. Labratory Medicine, 2011, 26(6): 387-389  
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外周血STC-1mRNA测定及其在结直肠癌诊断中的价值
杜玉珍1, 张海晨2, 李莉1, 高锋1
1. 上海交通大学附属第六人民医院检验科,上海 200233
2. 上海徐汇区中心医院检验科,上海 200031

作者简介：杜玉珍,女,1972年生,博士,主管技师,主要从事分子诊断学相关研究。

通讯作者：高锋,联系电话：021-64369181-58702。

摘要
目的

比较斯钙素(STC-1)mRNA在结直肠癌患者和健康人外周血中表达水平的差异,初步探讨STC-1 mRNA作为循环肿瘤标志物的临床意义。

方法

采用荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测37例结直肠癌患者、18名健康人外周血STC-1 mRNA的表达水平,并对其中30例患者的癌胚抗原(CEA)和糖链抗原199(CA199)等血清肿瘤标志物进行比较分析。

结果

结直肠癌患者与健康人的外周血STC-1 mRNA表达水平差异有统计学意义,患者组高于健康组;以受试者工作特征(ROC)曲线分析,发现STC-1 mRNA作为结直肠癌诊断指标具有较高的敏感性和特异性,其曲线下面积为0.730;以0.5为表达阳性界值,STC-1 mRNA检出结直肠癌的效能优于血清肿瘤标志物CEA和CA199的联合应用。

结论

应用荧光定量RT-PCR检测结直肠癌患者外周血STC-1 mRNA 表达水平具有较高的诊断价值,其可能成为新的用于结直肠癌诊断的循环肿瘤标志物。

关键词: 斯钙素; 结直肠癌; 循环肿瘤标志物; 逆转录聚合酶链反应
中图分类号:R446.62 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)06-0387-03
Expressionanditssignificanceofstanniocalcin-1mRNAintheperipheralbloodofpatientswithcolorectalcancer
DU Yuzhen1, ZHANG Haichen2, LI Li1, GAO Feng1
1.DepartmentofClinicalLaboratory,ShanghaiSixthPeople'sHospital,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai 200233,China
2.DepartmentofClinicalLaboratory,ShanghaiXuhuiCentralHospital,Shanghai 200031,China
Abstract
Objective

To investigate the expression level of stanniocalcin-1 (STC-1) mRNA in peripheral blood of patients with colorectal cancer and discuss its clinical value as circulating tumor marker.

Methods

The fluorescent quantitation reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to detect STC-1 mRNA in the peripheral blood of 37 patients with colorectal cancer and 18 healthy subjects, and serum carcino-embryonic antigen (CEA) and carbohydrate antigen 199 (CA199) were detected among 30 of the patients and analyzed comparatively.

Results

The expression level of STC-1 mRNA in peripheral blood of patients with colorectal cancer was higher than that of the healthy subjects with statistical significance. By receiver operating characteristic (ROC) curve, the area under the curve was 0.730, and STC-1 mRNA as colorectal cancer diagnosis indicator had good sensitivity and specificity. Compared with the serum CEA and CA199 combined detection, STC-1 mRNA had a better diagnostic value, when the positive cut-off value was 0.5.

Conclusions

STC-1 mRNA detected by fluorescent quantitation RT-PCR is a method to determine colorectal cancer, and STC-1 mRNA may become a new circulating tumor marker of colorectal cancer.

Keyword: Stanniocalcin-1; Colorectal cancer; Circulating tumor marker; Reverse transcription polymerase chain reaction

结直肠癌是我国人群中最常见的恶性肿瘤之一,其发病率在各种恶性肿瘤中仅次于肺癌及乳腺癌而排在第3 位,死亡率位于第4 位[ 1]。目前,虽然结直肠癌患者接受了以手术为主的根治术,但仍有约50%的患者死于手术后的复发和转移。因此,早发现、早诊断、早治疗对于结直肠癌的预后极为重要。斯钙素(stanniocalcin-1,STC-1)是一种糖蛋白激素,其在鱼体的基本生理功能是抑制钙(Ca2+)的吸收和促进磷酸盐的重吸收,在人和哺乳动物中其功能较为复杂[ 2]。近年的研究发现,STC-1 在人类肿瘤的发生、发展过程中具有重要作用[ 3]。有文献报道STC-1 mRNA 在多种肿瘤组织内普遍高表达,在非肿瘤人群骨髓和血液中不表达,因此,推测人STC-1可能成为一个新的肿瘤标志物[ 4]。本研究比较了STC-1 mRNA在结直肠癌患者与健康人外周血表达水平的差异,同时结合血清肿瘤标志物癌胚抗原(CEA)和糖链抗原199(CA199),初步探讨了STC-1 mRNA基因作为结直肠癌循环肿瘤标志物的诊断价值。

材料和方法
一、材料

1. 研究对象 在2008年1至4月间,收集上海市第六人民医院37例结直肠癌患者外周血,其中男22例,女15例,年龄30~82岁,均经临床病理确诊。采集初发、复发或因常规化疗入院治疗患者的治疗前外周血,并收集同期其他血清肿瘤标志物(CEA和CA199)的检测结果。另外,收集18名健康体检志愿者的外周血作为对照组,其中男11名,女7名,年龄25~50岁。

2. 试剂与仪器 Trizol试剂为Invitrogen公司产品,逆转录(RT)试剂盒及聚合酶链反应(PCR)试剂盒为日本Takara公司产品;荧光定量PCR仪为美国ABI公司的ABI PRISM 7000 Sequence Detection system,离心机为eppendorf centrifuge 5417R。

二、方法

1. 样本前处理 收集200 μL静脉抗凝血(乙二胺四乙酸抗凝),离心去血浆,加生理盐水至250 μL,再加入750 μL Trizol试剂吹打混匀,-80 ℃储存或进行RNA提取。RNA提取按Trizol说明书操作,行RNA电泳鉴定RNA提取质量。取1 μg总RNA进行cDNA合成,cDNA合成按逆转录酶使用说明书进行。

2. 荧光定量PCR扩增(相对标准曲线法) (1)标准曲线制作及相对表达定量:将所选样本的cDNA模板以原倍和5倍梯度稀释,即1∶5、1∶25、1∶125和1∶625,按样本PCR扩增体系进行扩增。由ABI 7000自动生成相对定量标准曲线,获得斜率用于样本相对表达水平的计算[ 5]。计算公式如下:

F=1 0ΔCT,T/AT-ΔCT,R/AR

F指目的基因的相对表达水平,△CT,T代表试验组减去对照组目的基因CT值的差,△CT,R代表试验组减去对照组参照基因CT值的差,AT和AR分别是目的基因和参照基因的扩增斜率;(2)扩增体系: cDNA模板1 μL、引物(10 μmol/L)0.4 μL、ROX校正染料(50×) 0.4 μL,加入灭菌去离子双蒸水至总体积20 μL。所有样本均做双复管;(3)PCR反应条件:预变性,95 ℃ 10 s;95 ℃ 5 s, 60 ℃ 20 s,40个循环。

三、统计学方法

用SPSS 13.0软件进行数据分析。结直肠癌患者与健康人STC-1 mRNA表达水平的比较,数据分布经正态性检验后,用秩和检验;STC-1 mRNA检测结直肠癌敏感性和特异性的评价用受试者工作特征(ROC)曲线分析;STC-1 mRNA与其他肿瘤标志物检出率的比较用McNemar检验。 P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果
一、结直肠癌组与健康组STC-1 mRNA相对表达水平的比较

对2组结果的统计比较,经正态性检验发现样本数据呈偏态分布,因此,用秩和检验进行组间比较,发现2组STC-1 mRNA的表达水平差异有统计学意义( P<0.05),结直肠癌组[0.349(0.077~2.551)]高于健康组[0.192(0.061~0.589)]。

二、STC-1 mRNA作为结直肠癌诊断指标的价值

将2组数据合并,用ROC曲线进行敏感性和特异性的综合评价,发现ROC曲线下面积为0.730(95%可信区间:0.601~0.860, P<0.01),因此,认为STC-1 mRNA作为结直肠癌的循环肿瘤标志物具有较高的诊断价值,见 图1。

图1 STC-1 mRNA诊断结直肠癌的ROC曲线

三、STC-1 mRNA与血清肿瘤标志物CEA和CA199联合应用的检出率比较

本研究37例患者中有30例血样与STC-1 mRNA同步做了血清CEA和CA199浓度检查,因此,对这30组数据进行了阳性检出率的比较。将STC-1 mRNA相对表达水平高于0.5定义为阳性,CEA和CA199中一项指标阳性即为阳性,结果2种方法检出率不同,STC-1 mRNA的检出效能高于CEA和CA199( χ2=4.01, P<0.05),见 表1。

表1 STC-1 mRNA与CEA和CA199比较对结直肠癌的检出情况
讨 论

STC-1在许多组织表达,如心、肺、肝、肾、肾上腺、前列腺以及卵巢,其表达在细胞分化、骨形成、细胞增殖、妊娠时升高。近年的研究发现该基因在乳腺癌、胃癌、肠癌、白血病微小残留病灶及脉络丛肿瘤组织表达增高[ 6, 7],因此,认为STC-1可能成为一个新的肿瘤诊断分子标志物。STC-1在肿瘤进程中的功能还不清楚,但已有的研究发现P53、缺氧诱导因子(HIF-1)能诱导STC-1表达增强。STC-1 可以促进缺氧区域血管生成和提高肿瘤细胞的缺氧耐受,在维持肿瘤细胞的能量代谢、新血管形成及肿瘤转移中起重要作用[ 8]。

在本研究中,我们运用荧光定量RT-PCR检测了37例结直肠癌患者和18名健康人外周血STC-1 mRNA的表达情况,发现结直肠癌组和健康组的外周血均有STC-1 mRNA的表达,结直肠癌组的表达水平高于健康组。ROC曲线分析提示,STC-1 mRNA用作结直肠癌检测的肿瘤分子标志物具有较好的敏感性和特异性(曲线下面积0.730)。本研究虽然未设噪音组,但我们在试验过程中收集了2例下消化道非肿瘤病变患者的血样本,检测结果发现STC-1 mRNA的表达水平与健康人无差异。

CEA和CA199是临床应用较多的结直肠癌血清肿瘤标志物,他们的联合检测是目前较理想的结直肠癌诊断指标[ 9]。为比较STC-1 mRNA与临床已开展肿瘤标志物诊断性能的优劣,我们对结直肠癌患者中的30例患者同期收集血清样本做了CEA和CA199的检测。结果发现,STC-1 mRNA能检出30例中的20例为阳性结果,而CEA和CA199联合只能检出12例阳性结果,两者差异有统计学意义。这个结果在方法学上也是可以接受的,因为荧光定量RT-PCR是目前检测肿瘤标志物最敏感的方法之一。

本研究中采用的荧光定量RT-PCR其敏感性达到10-6~10-7,即相当于能从106~107细胞中检出其中一个异常细胞。但该方法在重复性和稳定性方面的局限性限制了其在临床的应用。本研究为保证试验结果的可靠性,在方法学上做了改进:(1)从若干常用内参照基因中筛选出相对稳定表达的β-葡糖苷酸酶(GUSB)作为本研究的内参照基因,保证了结果的稳定性(内参照基因的筛选另外成文);(2)用相对标准曲线法代替2-ΔΔCT法定量。相对标准曲线法比绝对定量法简便、经济,同时又比2-ΔΔCT法精确,是目前越来越受到认可的相对定量方法[ 10]。

从外周血中发现敏感、特异的肿瘤标志物用于早期诊断、预测肿瘤复发或远端转移,是近年肿瘤试验诊断学的一个热点。本研究用荧光定量PCR比较了外周血STC-1 mRNA在结直肠癌患者和健康人间的表达差异,并用ROC曲线评价其诊断性能,同时与临床较常用的肿瘤标志物进行了比较分析,结果提示STC-1 mRNA是十分有效的结直肠癌循环肿瘤标志物,但其临床应用价值还需结合临床病理资料进行更深入的评价。

The authors have declared that no competing interests exist.

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