引用本文
冯强, 孙续国, 张福江, 万春友, 魏蔚, 胡可胜, 郑芳. 类风湿关节炎患者血清转甲状腺素蛋白化学修饰的蛋白质组学分析. 2011, 26(3): 185-189
FENG Qiang, SUN Xuguo, ZHANG Fujiang, WAN Chunyou, WEI Wei, HU Kesheng, ZHENG Fang. Proteomics-based analysis on the detection of serum transthyretin modification in patients with rheumatoid arthritis. Labratory Medicine, 2011, 26(3): 185-189  
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类风湿关节炎患者血清转甲状腺素蛋白化学修饰的蛋白质组学分析
冯强1, 孙续国1, 张福江2, 万春友2, 魏蔚3, 胡可胜1, 郑芳1
1.天津医科大学医学检验系, 天津 300203
2.天津医院关节外科, 天津 300211
3天津医科大学总医院感染免疫科, 天津 300070

作者简介:冯强,女,1984年生,硕士,技师,主要从事自身免疫病研究。

通讯作者:郑芳,联系方式:022-60357712。

基金:天津市自然基金(07JCYBJC15800); 天津医科大学留学回国人员启动基金(2006xqd5); 天津医科大学科学基金(2009xk12)
摘要
目的

通过检测类风湿关节炎(RA)患者血清转甲状腺素蛋白(TTR)的化学修饰类型和含量,探讨其在RA早期诊断中的潜在作用。

方法

采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定39名RA患者[早期(<1年)16例,中晚期(>2年)23例]、20名骨性关节炎(OA)患者及20名健康体检者血清TTR含量;采用Western blot测定血清TTR分子聚合体比例;采用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术鉴定血清中TTR蛋白的化学修饰类型和比例。

结果

RA早期患者血清TTR含量为(502.46±109.25)mg/L,明显高于正常对照组[(424.98±118.52)mg/L]( P<0.05);RA中晚期患者[(440.67±94.15) mg/L]也有增高趋势,但与正常对照组比较差异无统计学意义( P=0.733);OA组TTR含量为(363.91±106.41)mg/L,与正常对照组比较差异无统计学意义( P=0.072)。血清TTR化学修饰有4种蛋白峰:质荷比(m/z) 13 749.86±1.48、m/z 13 829.63±2.76、m/z 13 870.70±2.70、m/z 13 927±5.77,分别对应野生型TTR(native TTR)、磺化TTR (sul-TTR)、半胱氨酰化TTR(cys-TTR)和半胱氨酰甘氨酰化TTR(cysgly- TTR),且TTR修饰比例随病程发生变化。

结论

RA患者血清TTR质谱分析发现 4个TTR蛋白峰,且修饰比例随病程不同而发生改变;早期RA患者血清TTR含量增加,血清TTR水平有可能作为RA早期诊断的潜在指标。

关键词: 转甲状腺素蛋白; 类风湿关节炎; 骨性关节炎; 蛋白质组学
中图分类号:R446.1 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)03-0185-05
Proteomics-based analysis on the detection of serum transthyretin modification in patients with rheumatoid arthritis
FENG Qiang1, SUN Xuguo1, ZHANG Fujiang2, WAN Chunyou2, WEI Wei3, HU Kesheng1, ZHENG Fang1
1.Department of Laboratory Medicine, Tianjin Medical University, Tianjin 300203,China
2.Joint Replacement Center, Tianjin Hospital, Tianjin 300211, China
3.Department of Infection Immunology, Tianjin Medical University General Hospital, Tianjin 300070, China
Abstract
Objective

To investigate the potential role of transthyretin (TTR) in the early diagnosis of rheumatoid arthritis (RA) by detecting the levels of TTR and types of its chemical modification in RA patients' sera with proteomics-based analysis.

Methods

Serum levels of TTR were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) from 39 RA patients [16 cases (course of disease <1 year) and 23 cases (>2 years)], 20 osteoarthritis (OA) patients and 20 age and sex matched healthy subjects. Western blot was used to determine the ratio of TTR polymers. The relative types and proportion of TTR modification in serum were identified by matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS).

Results

Serum levels of TTR were significantly higher in early stage RA patients [(502.46±109.25)mg/L] than those in healthy controls [(424.98±118.52)mg/L] ( P<0.05). TTR levels in middle and late stage patients [(440.67±94.15) mg/L] were shown to have increasing tendency, but there was no statistical difference with those in controls ( P=0.733). No significant differences were detected between OA patients [(363.91±106.41)mg/L]and healthy controls ( P=0.072). 4 major peaks of TTR were 13 749.86±1.48 mass-to-charge ratio (m/z),13 829.63±2.76 m/z, 13 870.70±2.70 m/z and 13 927±5.77 m/z, corresponding to native TTR, sul-TTR, cys-TTR and cysgly-TTR, respectively. Meanwhile, the proportion of TTR modification changed with the course of disease.

Conclusions

4 types of TTR peaks are found in serum, and the proportion of TTR modification in RA changes with the course of disease. Serum TTR levels are increased in early stage RA patients, and it may be a potential marker for the early diagnosis of RA.

Keyword: Transthyretin; Rheumatoid arthritis; Osteoarthritis; Proteomics
引言

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis, RA)是一种常见的慢性全身性自身免疫病, 全世界平均发病率约为1%。RA患者持续发病2年即可出现不可逆的骨关节破坏, 造成关节畸形和功能丧失。研究发现, 发病早期接受规范治疗的RA患者预后明显好于延期治疗者。因此早期诊断对RA患者的治疗及预后具有重要的临床意义。血清转甲状腺素蛋白(transthyretin, TTR)主要由肝细胞合成, 大量研究表明在肝脏功能损害、恶性肿瘤、急性应激以及营养不良时血清TTR蛋白水平降低[1, 2]。最近有报道指RA患者早期血清TTR含量增高, 提示血清TTR水平可作为RA早期诊断的潜在指标[3]。

蛋白质组学的基础研究与相关技术的发展, 为RA寻找新的生物标志物提供了新思路。其中基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)因具有灵敏度高、特异性强、高通量等优点, 且能够研究蛋白质的化学修饰而备受关注。我们的目的是利用蛋白质组学技术检测不同病程RA患者血清中TTR的含量和化学修饰类型, 探讨血清TTR水平变化的规律和不同的修饰类型在RA早期诊断中的潜在作用。

材料和方法
一、对象

收集2008年11月至2009年12月天津医科大学总医院感染免疫科RA患者39例(早期活动性16例, 病程< 1年, 均为初诊, 未服用过慢作用抗风湿药物; 中晚期23例, 病程> 2年), 男5例, 女34例, 年龄 28~75岁; 骨性关节炎(OA)患者20例, 男5例, 女15例, 年龄 54~82岁。RA 和OA的临床诊断均符合各自的诊断标准及分类标准。选取性别、年龄匹配的20名健康体检者作为正常对照组。所有对象空腹采集静脉血2 mL, 3 000 r/min(离心半径14.4 cm)离心10 min, 分离血清, 密封保存于-80 ℃待用。

二、仪器和试剂

人TTR-酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自越研生物科技有限公司; 脱脂奶购自德国HANSANO公司; 兔抗人前白蛋白购自丹麦DakoCytomation公司; 羊抗兔IgG(H+L)购自美国Bioword Technology公司; 二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购自北京康维世纪公司; α -氰基-4-羟基-肉桂酸(α -Cyano-4-hydroxy-cinnamic acid, HCCA)及脱辅基肌红蛋白均购自美国sigma公司。

Multiskan MK3 酶标仪(上海热电仪器有限公司); ChampChemibasic全自动凝胶成像分析系统(北京赛智创业科技有限公司); MALDI-TOF-MS分析仪(包括 Kratos PC Axima CFR plus V2.4.0及 Kratos Analytical Version 2.4 Launchpad数据处理系统, 日本岛津公司, 由中科院植物研究所提供)。

三、方法

1. ELISA检测TTR含量

采用96孔ELISA双抗夹心法检测血清TTR含量, 按说明书操作。用样本稀释缓冲液将血清1∶ 2 000稀释, 每孔加入样本50 μ L, 室温反应30 min, PBS洗涤5次, 每次30 s。洗涤后, 加入酶结合物室温反应30 min, 洗涤5次, 37 ℃避光显色15 min, 加入50 μ L终止液终止反应, 450 nm测定吸光度值。

2. Western blot 测定TTR分子聚合体

4组血清样本各取适量血清与等体积上样缓冲液混合, 95 ℃加热10 min, 行 5%-14% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)电泳, 140 ~160 V 3 h。将电泳分离结果转膜, 160 mA 1.5 h, 用含 5%脱脂奶的三羟甲基氨基甲烷-Tween 20缓冲盐水(TBST)室温封闭1 h。加入1∶ 2 000稀释的兔抗人前白蛋白, 室温孵育1.5 h, TBST室温下脱色摇床洗2次, 每次10 min, 再用三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水(TBS)洗10 min。然后加入1∶ 5 000稀释的HRP标记羊抗兔IgG(H+L), 室温下摇床孵育1.5 h, 再用TBST洗2次, 每次10 min, TBS洗10 min, DAB显色, ChampChemibasic全自动凝胶成像分析系统对结果进行检测、扫描和分析。

3. MALDI-TOF-MS测定血清TTR的化学修饰

随机选取RA早期组、中晚期组及OA组、正常对照组患者血清样本各6份进行MALDI-TOF-MS分析。吸取血清100 μ L, 加入适量兔抗人前白蛋白涡旋混匀后, 4 ℃冰箱静置过夜。生理盐水洗涤后加入适量醋酸充分混合, 进行MALDI-TOF-MS分析。用标准品校正仪器, 选用HCCA为基质液, 脱辅基肌红蛋白[质荷比(m/z)16 952.27]作为内标, 取2 μ L样本上样, 检测样本, 获得由不同m/z的蛋白峰构成的质谱图。结果采用Kratos Analytical Version 2.4 Launchpad软件进行分析。

四、统计学方法

所有数据采用SPSS 11.5软件包进行分析。计量资料以 ± s表示, 各组间数据的比较依据资料的性质, 采用非参数检验; 并做变量间相关性分析。检验水准为双侧α =0.05。

结果
一、各组血清TTR含量

正常对照组血清TTR水平测定结果在国内外报道的生理水平范围内。RA早期患者组血清TTR含量明显高于正常对照组(P< 0.05); RA中晚期患者组TTR均值虽高于正常对照组, 但差异无统计学意义(P> 0.05)。OA患者组与正常对照组之间血清TTR水平差异无统计学意义(P> 0.05)。见表1。

表1 RA组、OA组及正常对照组血清TTR含量比较(± s)
二、 血清中TTR分子聚合体比例

经Western blot分析, 各组血清样本均发现2条TTR反应带, 相对分子质量分别为14 000和28 000。见图1。提示此 2条检测条带分别为TTR单体和二聚体。分别测量14 000和28 000 条带处TTR蛋白占总TTR蛋白的比例, 发现各组14 000 TTR所占比例无明显变化, 而RA患者28 000 TTR比例低于正常对照人群。见图2。

图1 血清TTR Western blot结果注:1~3为正常对照者, 4~6为OA患者, 7~9为RA早期患者, 10~12为RA中晚期患者

图2 血清TTR Western blot结果定量分析注:(a)为TTR二聚体; (b)为TTR单体

三、 TTR蛋白的化学修饰

MALDI-TOF-MS质谱图分析血清TTR的化学修饰, 各组均发现4种类型的TTR蛋白峰, 分别是m/z 13 749.86± 1.48、m/z 13 829.63± 2.76、m/z 13 870.70± 2.70、m/z 13 927± 5.77。见图3。经计算处理, 分别对应野生型TTR(native TTR)、磺化TTR(sul-TTR)、半胱氨酰化TTR(cys-TTR)和半胱氨酰甘氨酰化TTR(cysgly-TTR)。分析上述各组4种类型TTR所占的比例, 发现与正常对照组比较, 6例RA早期患者中有5例cys-TTR化学修饰比例下降, 3例sul-TTR修饰比例升高。结果提示TTR修饰比例在RA早期组与中晚期组之间发生改变。

图3 MALDI-TOF-MS法分析血清TTR的化学修饰类型注:(a):RA早期组; (b):RA中晚期组; (c):OA组; (d):正常对照组

讨论

RA是抗原驱动, T细胞介导的自身免疫性致残性疾病。大量研究证明, 早期诊断和早期治疗是RA取得良好预后的唯一途径。寻找RA早期诊断的生物标志物, 提高RA早期诊断率, 是临床亟待解决的难题。X线、CT等影像学诊断方法在临床应用广泛, 但这些方法基于关节发生明显病理损害, 导致关节形态学改变, 属于晚期诊断指标。利用蛋白组学的方法寻找生物标志物将为早期诊断RA开辟新的途径。本研究利用质谱技术解析RA患者血清TTR蛋白的化学修饰, 将为RA病理机制及其诊断标志物的研究提供实验依据。

人TTR蛋白由127个氨基酸组成, 相对分子质量为14 000, 血清TTR蛋白 90%以上来源于肝实质细胞合成分泌。由于半寿期仅为1.9 d, 能迅速反应蛋白能量平衡状态, 并且作为生物标志物已经应用于评价肝实质细胞功能和反映机体营养状态[4]。健康人血清TTR水平较稳定, 一般维持在 20~40 mg/dL之间。TTR作为感染的负向蛋白, 在感染时血清含量降低[4, 5]。最近的研究显示RA早期患者血清TTR水平明显增高 [3]。有报道认为一些抗炎药和抗TNF药物能够影响血清TTR水平[5]。

本研究依据病程将RA患者分为早期和中晚期2组, 分别检测血清TTR水平, 同时测定了正常对照组及非自身免疫疾病OA患者的血清TTR水平。结果显示早期RA组血清TTR水平有明显增高, 与以前报告研究结果相似, 但中晚期组RA患者与对照组之间无明显差别。本研究结果与其他研究组的报道一致。RA中晚期血清TTR水平降低的原因有多种, 其中免疫损害、营养以及治疗药物等均可影响血清TTR水平, 提示血清TTR水平可能在RA患者的早期具有潜在诊断价值。

本研究组之前报道了利用免疫沉淀结合MALDI-TOF-MS的方法测定了家族性多发性淀粉样变性神经损害(FAP)患者和健康人群血清TTR的化学修饰, 发现人血清TTR蛋白能够发生化学修饰[6, 7], 且血清与脂蛋白中TTR化学修饰的程度不同, 提示机体代谢与TTR修饰有关[8]。最近Ueda等[9]报道利用质谱技术测定TTR化学修饰, 其重复性好、稳定性高, 具有临床检验诊断潜能。为探讨TTR化学修饰在RA诊断中的作用, 本研究采用免疫沉淀结合MALDI-TOF-MS的方法, 分析上述4组血清中TTR蛋白的化学修饰, 发现主要存在4种TTR蛋白峰, 提示RA患者血清TTR蛋白能够发生化学修饰, 且TTR修饰比例随病程而发生改变。对照组测定结果与有关文献报道一致[10]。

血清TTR蛋白在SDS存在条件下, 95 ℃水浴 10 min变性, 经SDS-PAGE电泳, Western blot分析血清TTR的聚合体成分。结果显示, 变性条件下血清存有TTR单体和二聚体2种形式, 通过计算比例发现, 随着RA患者病程的延长, 二聚体TTR的比例降低。MALDI-TOF-MS分析TTR修饰的结果表明, RA早期患者血清cys-TTR的修饰比例下降, 而中晚期RA患者cys-TTR修饰比例与正常对照组无差异。本研究显示, 联合应用上述2种方法并对结果进行综合分析, 提示TTR的化学修饰可能对RA早期的诊断具有潜在价值。

综上所述, 本研究首次应用MALDI-TOF-MS技术测定RA患者血清TTR蛋白的化学修饰, 发现了的4个主要TTR蛋白峰, 且TTR修饰比例随病程不同发生改变。RA患者血清TTR含量早期明显增高, 提示血清TTR含量可能作为RA早期诊断的潜在指标。本研究受限之处在于例数不足, 目前我们已开展后续研究, 以进一步明确TTR蛋白的化学修饰在RA诊断中的作用。

The authors have declared that no competing interests exist.

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