引用本文
玉崧成, 王威, 李艳平, 吴拥军, 吴逸明. 定量测定硫酸软骨素的双抗体夹心ELISA的建立. 2011, 26(3): 143-146
YU Songcheng, WANG Wei, LI Yanping, WU Yongjun, WU Yiming. Establishment of a double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitative determination of chondroitin sulfate. Labratory Medicine, 2011, 26(3): 143-146  
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定量测定硫酸软骨素的双抗体夹心ELISA的建立
玉崧成1, 王威1, 李艳平2, 吴拥军1, 吴逸明1
1.郑州大学公共卫生学院,河南 郑州 450001
2.江苏省镇江市疾病预防控制中心,江苏 镇江 212003

作者简介:玉崧成,男,1983年生,硕士,助教,主要从事卫生检验研究。

通讯作者:吴拥军,联系电话:0371-67781450。

基金:国家自然科学基金资助项目(30972457)
摘要
目的

建立定量测定硫酸软骨素(CS)的双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA),并对其应用价值进行初步评价。

方法

以CS为抗原分别免疫Balb/c小鼠和日本大耳白兔,制备2种动物的多克隆抗体。用鼠抗体包被微孔板,兔抗体为第2抗体,辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔抗体为标记抗体,建立双抗体夹心ELISA,并对线性范围、精密度、回收率和方法学比较进行了评价。

结果

本研究建立的ELISA线性范围为2500 mg/L,批内和批间精密度分别为4.48%和5.97%,回收率在99.52%101.77%之间,与间苯三酚分光光度法测定结果具有良好的相关性( r=0.999 0, P<0.05)。

结论

建立的定量测定CS的双抗体夹心ELISA具有敏感性高、重现性好等优点,适合检测应用。

关键词: 硫酸软骨素; 酶联免疫吸附试验; 双抗体夹心法; 多克隆抗体
中图分类号:R446.61 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)03-0143-04
Establishment of a double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitative determination of chondroitin sulfate
YU Songcheng1, WANG Wei1, LI Yanping2, WU Yongjun1, WU Yiming1
1. College of Public Health, Zhengzhou University, Henan Zhengzhou 450001, China
2.Zhenjiang Center for Disease Control and Prevention, Jiangsu Zhenjiang 212003, China
Abstract
Objective

To establish a double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to determine the quantity of chondroitin sulfate (CS), and primarily evaluate the application value.

Methods

2 polyclonal antibodies were prepared by immunizing Balb/c mice and Japanese rabbits with CS as antigen. The microplate was coated by polyclonal antibody from mice, and the polyclonal antibody from rabbits was used as the second antibody. The goat anti-rabbit-antibody marked with horseradish peroxidase (HRP) was adopted as labeling antibody. A double-antibody sandwich ELISA was developed. The performance of this method was studied, including linear range, precision, recovery rate and methodology comparison.

Results

The linear range of this method was 2-500 mg/L. The within-run and between-run precisions were 4.48% and 5.97%, respectively. The recovery rate was from 99.52% to 101.77%. With phloroglucinol spectrophotometry as reference method, its correlation was good, and the correlation coefficient ( r) was 0.999 0 ( P<0.05).

Conclusions

The double-antibody sandwich ELISA to determine the quantity of CS showes high sensitivity and good repeatability. It could be applied to determine CS.

Keyword: Chondroitin sulfate; Enzyme-linked immunosorbent assay; Double-antibody sandwich method; Polyclonal antibody
引言

肺癌是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一, 如能早期发现可以使患者的5年生存率明显提高。据报道, 硫酸黏多糖可能是协助肺癌诊断的一个很好的指标[1, 2], 主要包括透明质酸 [3]和硫酸软骨素(chondroitin sulfate, CS)[4]。目前国内外报道的检测CS的方法很多[5], 如比色法[6]、色谱法[7]、配位滴定法[8]、原子吸收法[9]等, 但这些方法都有其自身的局限性。本研究旨在建立定量测定CS的双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)。

材料和方法
一、试剂和仪器

1. 试剂

Balb/c小鼠和日本大耳白兔购自河南省实验动物中心; 完全弗式佐剂和不完全弗式佐剂购自Sigma 公司; 酪蛋白购自Sangon公司; CS标准品购自Sigma公司; CS注射液购自某公司, 批号为050604; 辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔IgG、显色剂A[3, 3', 5, 5'-四甲基联苯胺(TMB)]和显色剂B均来自河南省生物工程技术研究中心。

2. 仪器

酶标仪(Wellscan MK3)、洗板机(Wellwash MK2) 美国Thermo公司产品; 96孔可拆式酶标板购自浙江省临海市化为分析器有限公司; 离心机为德国Eppendorf公司产品; DHP-600型电热恒温培养箱为北京市光明医疗仪器厂产品。

二、方法

1. 鼠抗CS抗体及兔抗CS抗体的制备

以CS为抗原分别免疫7周龄的Balb/c小鼠和4月龄的日本大耳白兔。免疫前取血制备阴性对照血清并于-20 ℃保存备用。初次免疫使用CS和等体积的完全佐剂溶液充分乳化后的乳浊液, 之后每隔2周用CS和等体积的不完全佐剂溶液充分乳化后的乳浊液加强免疫。采血并制备血清, 在-20 ℃冰箱内备用。

2. 抗体效价的检测

用一定浓度的CS包被酶标板, 封闭后依次加入系列稀释抗体、酶标二抗、显色剂及反应终止剂, 测定吸光度(A450)值。以判定为阳性的血清最高稀释倍数为血清抗体终点效价。

3. 双抗体夹心ELISA的建立

用一定稀释度的鼠抗血清包被酶标板, 37 ℃温育2 h; 洗涤, 用1%酪蛋白37 ℃下封闭2 h; 洗涤, 加入待测液; 洗涤, 加入一定稀释度的兔抗血清, 37 ℃温育2 h; 洗涤, 加入酶标二抗, 37 ℃温育30 min; 洗涤, 加入显色剂A、B, 37 ℃温育20 min后终止反应, 测定A450值。

4. 标准工作曲线的绘制

配制一系列浓度CS的标准品溶液, 用双抗体夹心ELISA对其测定。以A值为纵坐标, 以CS浓度的自然对数ln为横坐标, 绘制出标准曲线, 求出回归方程及相关系数, 并确定线性范围。

5. 特异性评价

选择同浓度的与CS结构相似的物质肝素(HP)以及其他干扰物质牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)作为待检样本, 分析检测结果, 判断其特异性。

6. 精密度评价

分别测定组内和组间高、中、低3个不同浓度的CS溶液的A值, 平行测定8次, 求平均相对标准偏差。

7. 回收率

用CS注射液配制高、中、低3个浓度的溶液, 并进行测定, 平行3次。同时, 向3个浓度CS注射液中加入已知浓度的CS溶液, 用双抗体夹心ELISA测定, 平行3次, 计算回收率。

8. 方法学比较

以间苯三酚分光光度法[6]为参比方法, 与本研究建立方法的测定结果进行比较。

三、统计学方法

应用SPSS 12.0软件进行Spearman等级相关分析和配对t检验进行统计分析, P< 0.05为差异有统计学意义。

结果
一、多克隆抗体效价的测定

鼠多克隆抗体的终点效价在1∶ 12 800左右; 兔多克隆抗体的终点效价为1∶ 128 000。

二、ELISA最适条件的选择

分别以鼠抗血清和兔抗血清包被微孔板, 选择理想的包被抗体, 结果见表1。对包被抗体、第2抗体和酶标抗体的工作浓度进行优化, 确立最终使用浓度, 见表2和表3。从表中的数据可以看出, 选择1∶ 200的鼠抗血清为包被抗体, 1∶ 20 000的兔抗血清为第2抗体, 羊抗兔酶标抗体的稀释度为1∶ 4 000时, 测定结果最理想。

表1 包被抗体的选择
表2 包被抗体和第2抗体工作浓度的优化
表3 HRP标记的羊抗兔抗体浓度的选择
三、工作曲线的绘制

用双抗体夹心ELISA测定一系列CS标准溶液, 以A值对ln作图, 可得回归方程为Y=0.320 2X+0.214 4, r=0.991 4, 线性范围是2500 mg/L。见图1。

图1 双抗体夹心ELISA检测CS的标准曲线图

四、特异性

特异性试验的结果显示, HP的A值(0.432)相对较高, 而BSA和OVA的干扰非常小, A值分别为0.093和0.102。由于HP和CS的结构非常相似, 且试验中使用多克隆抗体, 因此HP的干扰相对较高。特异性试验的结果说明除HP以外此方法的特异性良好。

五、精密度

批内相对标准偏差分别为7.82%、3.30%和2.32%, 平均相对标准偏差为4.48%; 批间相对标准偏差分别为11.8%、4.91%、1.20%, 平均相对标准偏差为5.97%。

六、回收率

回收试验的结果显示, 回收率在99.52%101.77%之间。可见, 此方法可满足CS的定量检测。见表4。

表4 CS注射液回收率测定结果(3次)
七、方法学比较

用间苯三酚分光光度法测定CS, 其标准曲线的回归方程为Y =0.001 1X-0.010 6, 其中X为CS的浓度, Y为A值, r = 0. 991 8(P< 0.05), 线性范围为200500 mg/L。用所建立的双抗体夹心ELISA和间苯三酚分光光度法对相同的溶液进行检测, 结果见表5。对检测结果进行相关性分析, 结果显示2种方法的测定结果具有良好的相关性(r=0.999 0, P< 0.05); 对检测结果进行配对t检验分析, 结果显示2种方法测定结果的差异无统计学意义(P> 0.05), 表明ELISA检测结果可靠。

表5 2种方法测定结果(mg/L)
讨论

虽然CS是相对分子质量在30 00050 000的黏多糖分子, 但由于其结构复杂, 所以CS能够作为完全抗原对异种动物进行免疫。通过用CS作为免疫原分别免疫了Balb/c小鼠和日本大耳白兔, 成功地制备了特异性良好的抗CS血清, 其效价血清终点效价分别为1∶ 12 800和1∶ 128 000。

本研究建立的定量测定CS的双抗体夹心ELISA线性范围较宽, 在2500 mg/L之间; 特异性良好, 干扰蛋白BSA及OVA对CS测定的干扰较小; 精密度较好, 批内平均相对标准偏差为4.48%, 批间平均相对标准偏差为5.97%; 回收率理想, 说明基质的干扰效应小; 以间苯三酚分光光度法为参考方法, 本研究建立的方法与其具有良好的相关性。因此, 本研究所建立的双抗体夹心定量测定CS的ELISA方法学性能良好。

肺癌患者肿瘤组织中黏多糖含量是正常肺组织中的黏多糖含量的1.73.5倍[4], 在肺癌发生早期, 患者血清中CS水平即可升高[10]。李成德等[11]用POLY实验室的LTA乳胶玻片试剂盒对肺癌人群和正常人群的血清硫酸黏多糖进行了定性分析, 结果表明肺癌人群的阳性率高达90.9%, 而正常人群的阳性率只有7.7%。本研究所建立的双抗体夹心ELISA是对CS进行定量分析。Baici等[12]对健康人血清中CS的浓度进行了测定, 其浓度范围在525 mg/L之间, 而肺癌患者血清CS浓度测定尚未见报道, 本研究所建方法在肺癌临床的应用价值有待进一步研究。必需提出, 由于与CS结构类似的HP对结果的干扰较大, 应用本研究所建立的方法测定CS时, 应绝对避免以HP为抗凝剂的抗凝血, 并注意患者用HP的药物记录。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] 霍建民, 屈庆云. 硫酸粘多糖片段检测对非小细胞肺癌诊断价值的探讨[J]. 中国实用内科杂志, 2002, 22(6): 334-335. [本文引用:1]
[2] Li F, Ten Dam GB, Murugan S, et al. Involvement of highly sulfated chondroitin sulfate in the metastasis of the Lewis lung carcinoma cells[J]. J Biol Chem, 2008, 283(49): 34294-34304. [本文引用:1] [JCR: 4.651]
[3] 戚良晨, 林雪松, 李长生. 肺癌组织中糖胺多糖含量和硫酸化特点研究[J]. 白求恩医科大学学报, 1999, 25(1): 44-46. [本文引用:1]
[4] Horai T. Glycosaminoglycans in human normal lung tissues and lung cancer tissues[J]. Nihon Kyopu Shikkan Gakkai Zasshi, 1990, 28(11): 1442-1449. [本文引用:2]
[5] 齐敬总, 闫晓玲, 王凤山. 硫酸软骨素含量测定方法介绍[J]. 中国生化药物杂志, 2002, 23(3): 162. [本文引用:1]
[6] 高华, 刘坤, 于兹东, 等. 间苯三酚分光度法测定硫酸软骨素的研究[J]. 中国生化药物杂志, 2000, 21(5): 247-248. [本文引用:2]
[7] 石瑞平, 周庆英. HPLC法测定硫酸软骨素含量[J]. 山东医药工业, 2002, 21(2): 15-16. [本文引用:1]
[8] 张关顺. 电位法测定硫酸软骨素的含量[J]. 海峡药学, 2004, 16(5): 92-93. [本文引用:1]
[9] 茅力, 吕志宏, 陈景衡, 等. 间接原子吸收法测定鲨鱼软骨粉中的硫酸软骨素[J]. 中华预防医学杂志, 1998, 46(3): 56-57. [本文引用:1]
[10] 张炜平. 肺癌相关肿瘤标志物的研究进展[J]. 临床肺科杂志, 2008, 13(2): 193-196. [本文引用:1]
[11] 李成德, 陈享, 李海珠, 等. 血清硫酸黏多糖片段和肿瘤相关物质群检测诊断非小细胞肺癌的价值[J]. 中国医师进修杂志, 2006, 29(19): 54-56. [本文引用:1]
[12] Baici A, Horler D, Moser B, et al. Analysis of glycosaminoglycans in human serum after oral administration of chondroitin sulfate[J]. Rheumatol Int, 1992, 12(3): 81-88. [本文引用:1] [JCR: 2.214]