引用本文
魏旭倩, 王伟祥, 王学锋, 吴方, 高锋. 外周血CEA mRNA、Survivin mRNA、MMP-2 mRNA和TIMP-2 mRNA水平与乳腺癌的关系. 2011, 26(2): 94-99
WEI Xuqian, WANG Weixiang, WANG Xuefeng, WU Fang, GAO Feng. Research on the relationship of mRNA expressions CEA,Survivin,MMP-2 and TIMP-2 in peripheral blood with breast carcinoma. Labratory Medicine, 2011, 26(2): 94-99  
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外周血CEA mRNA、Survivin mRNA、MMP-2 mRNA和TIMP-2 mRNA水平与乳腺癌的关系
魏旭倩1, 王伟祥1, 王学锋2, 吴方3, 高锋1
1. 上海交通大学附属第六人民医院检验科,上海 200233
2.上海交通大学医学院附属瑞金医院输血科,上海 200025
3.上海交通大学医学院附属瑞金医院老年科,上海 200025

作者简介:魏旭倩,女,1980年生,硕士,技师,主要从事临床检验工作。

通讯作者:高 锋,联系电话:021-64369181-8702。

基金:上海市科委基金资助项目(044119712)
摘要
目的

研究外周血癌胚抗原(CEA)、生存素(Survivin)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)及金属蛋白酶抑制剂-2(TIMP-2) mRNA表达与乳腺癌的关系。

方法

采用逆转录实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)检测54例乳腺癌患者和23名正常对照组外周血MMP-2 mRNA、TIMP-2 mRNA、 CEA mRNA和Survivin mRNA的表达水平。以正常对照组结果为正常参考范围,分析乳腺癌患者外周血CEA mRNA和Survivin mRNA表达的阳性率。

结果

乳腺癌患者外周血可检测到不同水平的CEA mRNA、Survivin mRNA、MMP-2 mRNA和TIMP-2 mRNA的表达。Ⅰ/Ⅱ期及Ⅲ/Ⅳ期乳腺癌组外周血MMP-2 mRNA表达量高于正常对照组( P<0.01);TIMP-2/MMP-2比值则低于正常对照组( P<0.05、 P<0.01);Ⅲ/Ⅳ期乳腺癌患者外周血CEA mRNA和Survivin mRNA表达量高于正常对照组( P<0.01)。Ⅲ/Ⅳ期乳腺癌患者外周血MMP-2 mRNA、CEA mRNA、Survivin mRNA表达量及TIMP-2/MMP-2比值与Ⅰ/Ⅱ期乳腺癌患者比较差异有统计学意义( P<0.01)。Ⅲ/Ⅳ期乳腺癌患者外周血CEA mRNA和Survivin mRNA表达的阳性率明显高于Ⅰ/Ⅱ期乳腺癌患者( P<0.01、 P<0.05)。

结论

采用逆转录real-time PCR检测外周血CEA、Survivin、MMP-2 mRNA的表达以及TIMP-2/MMP-2比值可以成为一种无创性乳腺癌辅助诊断、分期、转移的方法。

关键词: 基质金属蛋白酶-2; 金属蛋白酶抑制剂-2; 癌胚抗原; 生存素; 实时定量聚合酶链反应; 乳腺癌
中图分类号:R556 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)02-0094-06
Research on the relationship of mRNA expressions CEA,Survivin,MMP-2 and TIMP-2 in peripheral blood with breast carcinoma
WEI Xuqian1, WANG Weixiang1, WANG Xuefeng2, WU Fang3, GAO Feng1
1.Department of Clinical Laboratory,Shanghai Sixth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200233,China
2. Department of Clinical Transfusion,Ruijin Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200025,China
3. Department of Geriatric, Ruijin Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200025,China
Abstract
Objective

To study the relationship of the mRNA expression of carcinoembryonic antigen (CEA),Survivin,matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and tissue inhibitor of metalloproteinase-2(TIMP-2) in peripheral blood with breast carcinoma.

Methods

The expressions levels of CEA mRNA, Survivin mRNA, MMP-2 mRNA and TIMP-2 mRNA in 54 patients with of breast carcinoma and 23 healthy controls were detected by reverse transcription real-time quantitive polymerase chain reaction (PCR). The positive rates of the expressions of CEA mRNA and Survivin mRNA were analyzed, which referred to the results of controls as normal range.

Results

The different levels of the expression of CEA mRNA, Survivin mRNA,MMP-2 mRNA and TIMP-2 mRNA were detected in the peripheral blood of patients with breast carcinoma. The expressions of MMP-2 mRNA in breast carcinoma patients of stage Ⅰ/Ⅱand Ⅲ/Ⅳ were significantly higher than those in the control group( P<0.01). The ratio of TIMP-2/MMP-2 in breast carcinoma patients was significantly lower than that in the control group( P<0.05, P<0.01). The expressions of CEA mRNA and Survivin mRNA in stage Ⅲ/Ⅳ patients were significantly higher than those in the control group( P<0.01).The difference of the expressions of MMP-2 mRNA, CEA mRNA, Survivin mRNA and the ratio of TIMP-2/MMP-2 between stage Ⅲ/Ⅳ patients and stageⅠ/Ⅱ patients had statistical significance ( P<0.01). The positive rates of the expressions of CEA mRNA and Survivin mRNA in peripheral blood were significantly higher in stage Ⅲ/Ⅳ patients than in stage Ⅰ/Ⅱ patients ( P<0.01, P<0.05).

Conclusions

The reverse transcription real-time PCR for the mRNA expressions of CEA,Survivin and MMP-2 and the ratio of TIMP-2/MMP-2 in peripheral blood may be an assistant diagnosis method and can help for the diagnosis, staging and metastasis analysis of breast carcinoma in clinical practice.

Keyword: Matrix metalloproteinase-2; Tissue inhibitor of metalloproteinase-2; Carcinoembryonic antigen; Survivin; Real-time quantitive polymerase chain reaction; Breast carcinoma
引言

乳腺癌是我国常见的恶性肿瘤之一, 早期可发生隐匿性转移, 其浸润和转移的程度是影响预后的主要因素。如果能在亚临床阶段检测到微小转移灶, 则对疾病的分期、治疗及预后有重要意义。目前研究表明, 癌胚抗原(carcino-embryonic antigen, CEA)、生存素(Survivin)、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinases-2, MMP-2)及金属蛋白酶抑制剂-2(tissue inhibitor of metallo-proteinase-2, TIMP-2)在恶性肿瘤的发生、发展中起重要作用[1~3]。我们通过对乳腺癌患者外周血中CEA、Survivin、MMP-2和TIMP-2基因表达量的检测及分析, 探讨基因表达定量检测的临床意义及其与肿瘤发生和分期的关系, 为临床应用提供理论和实验依据。

材料和方法
一、研究对象

1.正常对照组

23名, 年龄30~68岁。系上海交通大学附属第六人民医院门诊体检正常者。均无心、肝、肾等器质性疾病史, 采血前1个月无服药史。

2.肿瘤组

收集上海交通大学附属第六人民医院2008年3月至2009年3月手术的54例乳腺癌患者, 所有患者均为女性, 年龄33~70岁。手术前未经放疗、化疗, 其中非浸润性癌6例(包括导管内癌5例、小叶原位癌1例), 浸润性癌48例(包括浸润性导管癌40例、浸润性小叶癌1例、髓样癌4例); Ⅰ /Ⅱ 期22例, Ⅲ /Ⅳ 期32例, 有淋巴结转移者39例。样本的收集和处理由不同人员负责。

二、样本的处理和RNA的抽提

静脉采血6~10 mL, 0.109 mol/L枸橼酸钠抗凝(抗凝剂由高压过的DEPC水配制), 用淋巴细胞分层液(Ficoll-Paque PLUS, Amersham Biosciences 公司)分离外周血单个核细胞, 加入Trizol 1 mL(Invitrogen 公司)后, 用经典方法抽提总RNA。

三、cDNA的制备

用RNA电泳证实RNA未降解, 测定所抽提RNA浓度。20 μ L的反转录体系包括:1 μ g总RNA, 200 U MMLV逆转录酶, 4 μ L 5× First-Stand缓冲液, 200 mmol DTT, 40 U RNA酶抑制剂, 20 mmol dNTPs, 0.2 μ g 随机引物(Random Primer, 试剂盒为上海申能博彩公司产品)。反应条件:37 ℃ 1 h, 95 ℃ 5 min。逆转录产物cDNA置-80 ℃冰箱中待测。

四、实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)

用ABI公司的引物设计软件Primer Express 设计用于Real-time PCR的管家基因GAPDH和TIMP-2的mRNA引物, MMP-2、CEA、Survivin的引物分别按文献[4~6]设计, 引物序列见表1。20 μ L反应体系包括:10 μ L的2× SYBR Green Master Mix(ABI公司的SYBR Green试剂盒), 10 μ mol/L的上、下游引物各1 μ L, 1 μ L cDNA, GAPDH为内参照。每个样本的每个待测项目均测3次, 取平均值。反应条件:95 ℃变性10 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min, 共40个循环。使用的仪器为ABI PRISM 7000 Sequence Detection System。

表1 实时荧光定量PCR引物
五、统计学方法

Real-time PCR输出的结果是Ct值, 样本的CEA、Survivin、MMP-2或TIMP-2的Ct值减去内参GAPDH的Ct值即为Δ t, 扩增产物的表达量即为2-Δ t。计量资料用t检验或t'检验对两样本均数进行分析, 计数资料用χ 2检验分析两样本率。

结果
一、部分样本的real-time PCR扩增曲线见图1~5。

图1 CEA扩增曲线

图2 Survivin 扩增曲线

图3 MMP-2扩增曲线

图4 TIMP-2扩增曲线

图5 GAPDH扩增曲线

二、乳腺癌组外周血MMP-2 mRNA表达量高于正常对照组

(P< 0.01); TIMP-2/MMP-2比值则低于正常对照组(Ⅰ /Ⅱ 期 P< 0.05、Ⅲ /Ⅳ 期 P< 0.01); Ⅲ /Ⅳ 期乳腺癌患者外周血CEA mRNA和Survivin mRNA表达量高于正常对照组(P< 0.01)。Ⅲ /Ⅳ 期乳腺癌患者外周血MMP-2 mRNA、CEA mRNA、Survivin mRNA表达量及TIMP-2/MMP-2比值与Ⅰ /Ⅱ 期乳腺癌患者比较差异有统计学意义(P< 0.01), 见表2。

表2 乳腺癌患者与正常对照组各指标外周血mRNA的表达量(2-Δ t× 10-3)
三、以正常对照组结果为正常参考范围, 超过此范围者为阳性。

各期乳腺癌患者外周血CEA mRNA和Survivin mRNA表达的阳性率结果, 见表3。

表3 各期乳腺癌患者CEA mRNA和Survivin mRNA表达阳性率的比较[例(%)]

四、以正常对照组结果为正常参考范围, 高于/低于正常参考范围者为升高(↑ )/降低(↓ )。各期乳腺癌患者MMP-2 mRNA和TIMP-2 mRNA及TIMP-2/MMP-2比值的变化, 见表4。

表4 各期乳腺癌患者MMP-2 mRNA、TIMP-2 mRNA及TIMP-2/MMP-2比值的变化(%)
讨论

乳腺癌是妇女最常见的肿瘤之一, 近年来乳腺癌的发病率呈明显上升趋势。在很多地方, 乳腺癌已经居于妇女恶性肿瘤的首位。早期发现诊断乳腺癌越来越受到关注。近40%~50%乳腺癌患者在初始治疗后5年内复发转移。寻找乳腺癌的肿瘤标志物并探索其临床应用价值受到众多研究者关注。

乳腺癌为上皮来源性肿瘤, 具有上皮来源性的细胞生物学特征。CEA属于上皮组织特异性标志基因, 通常作为消化道肿瘤的标志物, 但研究者发现, CEA高表达于乳腺癌组织, 而正常淋巴、血液、骨髓等组织中不表达, 使CEA mRNA检测可以作为判断乳腺癌转移的一种方法。Janku等[7]发现使用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测骨髓中CEA水平可以作为乳腺癌的检测方法。本研究中54例乳腺癌患者外周血CEA mRNA阳性率与An等[8]报道的阳性率相近。本研究显示乳腺癌患者外周血CEA mRNA的表达与肿瘤分期相关, 与临床上乳腺癌分期越晚转移机会越多相符合, 提示动态观察外周血中CEA mRNA表达有助于判断乳腺癌患者的预后以及临床对肿瘤分期和治疗方案的选择。

MMP-2是基质金属蛋白酶(MMPs)家族的主要成员, 通过降解基底膜和基质、突破基质屏障、促进肿瘤侵袭和转移。而TIMP-2则通过抑制MMP-2活性来抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。因此, MMPs与金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)之间活性的平衡失调是导致肿瘤细胞侵袭和转移的重要原因。Baker等[9]应用免疫组化方法发现MMP-2主要在乳腺癌细胞胞质中表达, 在正常组织或良性肿瘤中无表达或低表达。本研究结果显示乳腺癌患者外周血MMP-2 mRNA的表达量与正常对照组有明显差异(P< 0.01), 而且Ⅲ /Ⅳ 期和Ⅰ /Ⅱ 期之间的差异也有统计学意义(P< 0.01)。提示MMP-2可以作为乳腺癌的外周血标志, 并可以作为分期和治疗选择的依据之一。

TIMPs是机体内MMPs的天然抑制蛋白, 可以1∶ 1的非共价键形式与活化的MMP-2形成复合物, 有效地抑制MMP-2的胶原分解活性及明胶活性。Kim等[10]研究指出肿瘤组织中TIMP-2和MMP-2的表达均高于正常组织, 这是由于宿主细胞或肿瘤细胞受肿瘤的刺激后可以产生更多的TIMP-2, 高表达的TIMP-2能明显降低原发性肿瘤的生长、局部浸润与转移, 并能抑制肿瘤细胞的血管外生长。因此, 评价MMP-2和TIMP-2之间的平衡比单独采用MMP-2指标更有利于了解肿瘤的进展及预后情况。本研究显示Ⅰ /Ⅱ 期乳腺癌患者外周血TIMP-2 mRNA表达明显高于正常对照组(P< 0.05), 而Ⅲ /Ⅳ 期则无差异。这提示在肿瘤的早期, TIMP-2随着MMP-2升高, 互相抑制, 但是到中晚期TIMP-2和MMP-2之间出现明显失衡, 这从TIMP-2/MMP-2比值可以更清楚的发现这种失衡, 这也提示TIMP-2/MMP-2比值可以作为肿瘤分期的标志。

Nasu等[12]用荧光法测定通过RT-PCR取得的Survivin mRNA在乳腺癌中的表达情况时发现Survivin在乳腺癌组织中的表达阳性率为90.2%(37/41), 而在邻近的正常组织中为23%(3/13), 两者表达的差异与临床病理因素无关。因此Survivin可作为诊断乳腺癌的一个有效的独立标志物。Izawa等[12]对39例乳腺癌患者肿瘤组织中c-erbB2、PLU-1和Survivin的表达情况进行定量分析, c-erbB2、PLU-1和Survivin的肿瘤阳性表达率分别是20.5%、7.7%和69.2%; 同时, PLU-1阳性表达的患者Survivin均为阴性表达, 可见Survivin是一种比目前临床上常用的c-erbB2和PLU-1更有诊断意义的乳腺癌标志物。本研究发现Ⅲ /Ⅳ 期乳腺癌患者外周血Survivin mRNA的表达量明显高于对照组及Ⅰ /Ⅱ 期乳腺癌患者(P< 0.01); 表达阳性率也明显高于Ⅰ /Ⅱ 期乳腺癌患者(P< 0.05)。Ⅰ /Ⅱ 期乳腺癌患者外周血Survivin的表达量虽略高于对照组, 但差异无统计学意义(P> 0.05)。由此可见, Survivin在乳腺癌患者外周血中的表达与乳腺癌的分期有关, 可以作为肿瘤分期的标志。

探讨恶性肿瘤的外周血表达标志物一直是临床工作者研究的热点, 通过对不同肿瘤指标的探讨有望提高人们对肿瘤发生早期辅助诊断和分期的认识。外周血CEA、Survivin、MMP-2的表达以及TIMP-2/MMP-2比值可以成为乳腺癌发生和分期的观测指标。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] 孟冬娅, 胡晓芳, 高洪福, 等. 检测血清VEGF、CEA、TSGF在肿瘤中的临床意义[J]. 中国现代医学杂志, 2004, 14(1): 117-118. [本文引用:1]
[2] 管海涛, 薛锋杰, 王西京, 等. 乳腺癌中survivin表达的预后价值[J]. 现代肿瘤医学, 2007, 15(7): 938-940. [本文引用:1]
[3] Jinga DC, Blidaru A, Condrea I, et al. MMP-9 and MMP-2 gelatinases and TIMP-1 and TIMP-2 inhibitors in breast cancer: correlations with prognostic factors[J]. J Cell Mol Med, 2006, 10(2): 499-510. [本文引用:1] [JCR: 4.753]
[4] Wu WT, Chen CN, Lin CI, et al. Lysophospholipids enhance matrix metalloproteinase-2 expression in human endothelial cells[J]. Endocrinology, 2005, 146(8): 3387-3400. [本文引用:1] [JCR: 4.717]
[5] Ho SB, Hyslop A, Albrecht R, et al. Quantification of colorectal cancer micrometastases in lymph nodes by nested and real-time reverse transcriptase-PCR analysis for carcinoembryonic antigen[J]. Clin Cancer Res, 2004, 10(17): 5777-5784. [本文引用:1] [JCR: 7.837]
[6] Kumazawa Y, Kawamura K, Sato T, et al. HCG up-regulates survivin mRNA in human granulosa cells[J]. Mol Hum Reprod, 2005, 11(3): 161-166. [本文引用:1] [JCR: 4.542]
[7] Janku F, Srovnal J, Korinkova G, et al. Molecular detection of disseminated breast cancer cells in the bone marrow of early breast cancer patients using quantitative RT PCR for CEA[J]. Neoplasma, 2008, 55(4): 317-322. [本文引用:1] [JCR: 1.574]
[8] An XY, Egami H, Hayashi N, et al. Clinical significance of circulating cancer cells in peripheral blood detected by reverse transcriptase-polymerase chain reaction in patients with breast cancer[J]. Tohoku J Exp Med, 2001, 193(2): 153-162. [本文引用:1] [JCR: 1.367]
[9] Baker EA, Stephenson TJ, Reed MW, et al. Expression of proteinases and inhibitors in human breast cancer progression and survival[J]. Mol Pathol, 2002, 55(5): 300-304. [本文引用:1] [JCR: 1.861]
[10] Kim TJ, Rho SB, Choi YL, et al. High expression of tissue inhibitor of metalloproteinase-2 in serous ovarian carcinomas and the role of this expression in ovarian tumorigenesis[J]. Hum Pathol, 2006, 37(7): 906-913. [本文引用:1] [JCR: 2.843]
[11] Nasu S, Yagihashi A, Izawa A, et al. Survivin mRNA expression in patients with breast cancer[J]. Anticancer Res, 2002, 22(3): 1839-1843. [本文引用:1] [JCR: 1.713]
[12] Izawa A, Kobayashi D, Nasu S, et al. Relevance of c-erbB2, PLU-1 and survivin mRNA expression to diagnostic assessment of breast cancer[J]. Anticancer Res, 2002, 22(5): 2965-2969. [本文引用:2] [JCR: 1.713]