引用本文
王剑飚, 樊绮诗, 倪麟, 倪培华, 姚玉峰. 人附红细胞体感染实验诊断方法的建立. 2011, 26(11): 784-790
WANG Jianbiao, FAN Qishi, NI Lin, NI Peihua, YAO Yufeng. Establishment of diagnostic methods to detect eperythrozoon in human. Labratory Medicine, 2011, 26(11): 784-790  
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《检验医学》编辑部
人附红细胞体感染实验诊断方法的建立
王剑飚1, 樊绮诗1, 倪麟2, 倪培华2, 姚玉峰3
1.上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科,上海 200025
2.上海交通大学医学院检验系,上海 200025
3.上海交通大学医学院病原生物学教研室,上海 200025

通讯作者:姚玉峰,联系电话:021-64370045-600612。

作者简介:王剑飚,男,1975年生,学士,副主任技师,主要从事临床检验工作。

摘要
目的

比较瑞氏-吉姆萨染色、吖啶橙荧光染色以及聚合酶链反应(PCR)对人附红细胞体的检出率,探索最可靠的检测人附红细胞体病的方法。

方法

选取体检健康人50名,同时从白血病及肾移植患者中分别选取50例,使用瑞氏-吉姆萨染色法以及吖啶橙荧光染色法检测附红体的感染率,同时选取1例2种方法检测结果均为强阳性的标本,根据GenBank中已收录的猪、牛、羊、猫、鼠等5种附红细胞体的16S rRNA基因序列设计一对特异性引物,初步建立人附红体病的分子诊断方法。

结果

体检健康人群中瑞氏-吉姆萨染色法以及吖啶橙荧光染色法检出率分别为32%和24%,白血病组的检出率分别为94%和62%,肾移植组的检出率分别为88%和68%,同时初步建立了人附红细胞体病的分子诊断方法,但需进一步研究将其完善。

结论

吖啶橙荧光染色法最适合临床作为人附红细胞体病的临床检测方法。

关键词: 附红细胞体; 瑞氏-吉姆萨染色; 吖啶橙; PCR; 16S rRNA
中图分类号:R446.11 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)011-0784-07
Establishment of diagnostic methods to detect eperythrozoon in human
WANG Jianbiao1, FAN Qishi1, NI Lin2, NI Peihua2, YAO Yufeng3
1.Department of Clinical Laboratory, Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200025, China
2.Faculty of Medical Laboratory Science, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200025, China
3.Laboratory of Bacterial Pathogenesis, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200025, China
Abstract
Objective

To compare the detection rates of the Wright-Giemsa staining method, acridine staining method and polymerase chain reaction (PCR) for detecting eperythrozoon in human, in order to search for a reliable method to detect eperythrozoon in human.

Methods

50 healthy subjects,50 leukemia patients and 50 kidney transplantation patients were enrolled in this study. The infection rates were detected by Wright-Giemsa staining method and acridine staining method. The samples with the results' both positive by the 2 methods were selected. A pair of primer specific to eperythrozoon in human was designed according to the 16S rRNA gene sequence of Eperythrozoon suis, Eperythrozoon wenyonii, Eperythrozoon ovis, Eperythrozoon haemofelis and Eperythrozoon coccoides from GenBank, and a diagnostic method was initially established to detect human eperythrozoonosis.

Results

The detection rates in healthy subject group, leukemia group and kidney transplantation group were 32%, 94%and 88% by Wright-Giemsa staining method, and the detection rates were 24%, 62%and 68% by acridine staining method. The diagnostic method was initially established to detect human eperythrozoonosis, and it should be improved further.

Conclusions

The acridine staining method is suitable for the clinical detection of eperythrozoon in human.

Keyword: Eperythrozoon; Wright-Giemsa staining; Acridine; Polymerase chain reaction; 16S rRNA

附红细胞体(Eperythrozoon),简称附红体,是寄生于红细胞表面、血浆及骨髓中的一群微生物。伯杰斯手册中将其归入立克次体[ 1],随着分子生物学发展,目前认为更接近于支原体。由附红细胞体寄生于多种动物和人的红细胞表面、血浆及骨髓液等部位的一种单细胞原生物所引起的一种人畜共患传染病称之为附红细胞体病(Eperythrozoonosis),简称附红体病。

目前世界上已有30多个国家和地区报道发生过本病,但多数为动物及家畜感染,由于附红体病的传播之广及其对畜牧经济所造成的危害之大,越来越引起全世界畜牧兽医界、外贸检疫界的重视。有资料表明[ 28],人感染附红体病的比例正在增加,对人体的危害也已逐渐引起医学界的关注。

材料和方法
一、材料

1. 主要试剂 瑞氏-吉姆萨染液为深圳贝索公司生产,吖啶橙购自Simga公司,PCR试剂盒、DNA Marker(DL 1000)以及蛋白酶K均购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)。

2. 仪器 光学显微镜为OLYMPUS公司 CX-21型;荧光显微镜为OLYMPUS公司 BX-61型;PCR仪购自杭州博日公司。

3. 样本 选取上海交通大学医学院附属瑞金医院体检健康人群50名、白血病患者50例、肾移植患者50例,使用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管取静脉血4mL。

二、方法

1. 瑞氏-吉姆萨染色镜检 取EDTA抗凝全血推血片1张,使用瑞氏-吉姆萨染液进行染色,在光学显微镜下使用1 000倍油镜观察( 图1),若在红细胞周围见折光性较强的椭圆形、月牙形等形态的细小颗粒,则判断为阳性[ 9]。

图1 瑞氏-吉姆萨染色[(a):阳性;(b):阴性 放大倍数 1 000×]

2. 吖啶橙荧光染色镜检 取EDTA抗凝全血推血片1张,放入无水乙醇中固定5 min,取出晾干后,使用0.25 μg/mL的吖啶橙染色,避光放置1 h后用蒸馏水冲洗阴干,之后滴加PBS,盖上盖玻片在荧光显微镜下使用蓝光进行观察,若见红细胞(镜下呈绿色)周围有不规则排列的黄绿色荧光颗粒,则判断为阳性( 图2)[ 10]。

图2 吖啶橙染色[(a):阳性;(b):阴性 放大倍数 400×]

3. 分子诊断方法

(1) 标本前处理:选取吖啶橙荧光染色与瑞氏-吉姆萨染色法结果均为强阳性临床症状符合附红体病并经临床治疗痊愈以及均为阴性的标本各1例,取EDTA抗凝全血2 mL,按照Ludwig E. Hoelzle[ 11]提供的方法从抗凝血中纯化附红细胞体。抗凝全血在常温下,1 500 r/min(离心半径15 cm)离心15 min,红细胞以及附着在红细胞上的附红体在最下层,弃去血浆和白细胞层。将载有附红体的红细胞沉淀溶于1mL的磷酸盐缓冲液中(PBS,137mmol NaCl,2.0mmol KCl,13.5mmol Na2HPO4,1.5mmol KH2PO4,pH值7.4),该缓冲液中含有0.015% Tween-20以及3%的EDTA,然后将该悬液放置在常温下轻轻摇动20 min使附红体从红细胞上脱落下来。之后在常温下2 000 r/min(离心半径15 cm)低速离心20 min,即可将红细胞以及红细胞碎片沉淀并弃去。将上述得到的附红体溶液[4℃,20 000 r/min(离心半径6 cm)超速离心120 min],使悬浮在液体中的附红体充分沉淀,弃去上清液,然后将得到的纯化后的附红体复溶于400 μL,0.15M无菌NaCl溶液中,并将其保存在-20℃直至使用;(2)DNA抽提:采用直接裂解法从上述得到的标本中抽提DNA。在400 μL标本中加入45 μL裂解液(100 mM Tris,10 mM EDTA,1M NaCl,pH值7.4),在上述液体中依次加入0.1 mg/mL的蛋白酶K和1.0 mg/mL的十二烷基磺酸钠(SDS)。完成上述步骤后,将标本放置在56℃水浴箱温浴2 h,然后加热至100℃维持10 min,使蛋白酶K失活。继而使用等体积的苯酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)处理样本2次。之后加入3M的醋酸钠0.1体积,同时加入2体积无水乙醇-70℃放置30 min,然后离心[10 000 r/min(离心半径6 cm),30 min],弃去上清液。在离心沉淀得到的DNA中加入50 μL70%乙醇,再次离心[10 000 r/min(离心半径6 cm),5 min],尽量吸弃上清液,然后将其溶于20 μL TE缓冲液中(10mM Tris,1mM EDTA,pH值8.0)。使用分光光度计在260 nm波长处检测DNA含量;(3) PCR方法的建立引物设计与合成: 根据GenBank中已发表的猪附红体 AF029394;牛附红体AF016546;鼠附红体AY171918 ;猫附红体 U88563及羊附红体AF338268的 16S rRNA基因序列设计1对特异性引物。

鼠AY171918 …ATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAATGCCATGTGAACGAT 398

猫U88563 …ATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAATACCATGTGAACGAT 384

羊AF338268 …ATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAATACCACGTGAACGAT 398

牛AF016546 …ATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAATACCACGTGAACGAT 365

猪AF029394 …ATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAATACCACGTGAACGAT 352

……………………………………………………………………………………………

鼠AY171918 … ATTAGATACCCCAGTAGTCCACACCGT…… 794

猫U88563 … ATTAGATACCCCAGTAGTCCACGCCGT…… 780

羊AF338268 … ATTAGATACCCCAGTAGTCCACGCCGT…… 817

牛AF016546 … ATTAGATACCCCAGTAGTCCACGCCGT…… 784

猪AF029394 … ATTAGATACCCCAGTAGTCCACGCCGT…… 771

上游引物:5'-TGGACGAAAGTCTGATGGAGCAATG(A)CCA-3'

下游引物:5'- GTGGACTACTGGGGTATCTAA -3'

猪附红体、牛附红体、羊附红体扩增产物为432 bp;鼠附红体、猫附红体 扩增产物为409bp。PCR扩增条件:PCR反应总体积为25 μL:10×PCR buffer(Mg2+ Plus)2.5 μL,dNTP 4 μL,Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.25 μL,上游引物与下游引物各0.1 μL,模板3 μL,双蒸水(ddH2O) 15.05 μL。PCR反应条件为:94℃ 5 min ,94 ℃ 40 s,55 ℃ 40 s,72 ℃ 90 s,循环扩增35次,最后72 ℃ 5 min,结束反应。应用肺炎支原体、解脲支原体、人形支原体、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌作为模板,按前面所述条件进行PCR扩增,检测本方法的特异性。使用紫外分光光度计,在波长260 nm处测定模板浓度,然后进行1∶10连续稀释,将稀释后的DNA分别以上述PCR体系进行扩增,并使用2%琼脂糖凝胶电泳检测结果,确定此方法所需最低模板量; 基因纯化与序列测定:将结果为阳性的PCR扩增产物纯化克隆后送往北京六合华大基因科技股份有限公司测序。

结果
一、瑞氏-吉姆萨和吖啶橙检测

瑞氏-吉姆萨染色法得到体检组阳性率为32.0%,白血病组为94%,肾移植组为88%。吖啶橙荧光染色法得到体检组阳性率为24%,白血病组为62%,肾移植组为68%。

二、PCR扩增

如 图3所示,1号孔与2号孔均为阳性标本,1号孔使用的引物来自参考文献[ 12],2号孔使用的引物为前述设计的引物,3号孔与4号孔为阴性标本,M为Marker(DL1000),由图可得2号孔在400与500之间出现了条带,基本确定该扩增产物为人附红细胞体DNA,但具体结果需进行测序结果出来后才可得出。

图3 PCR扩增结果

经紫外分光光度计测定,阳性标本模板DNA含量为3.3×102 μg/mL。按1∶10连续稀释(1号孔为10倍稀释,2号孔为100倍稀释……),结果表明稀释到1 000倍均能扩增出目的片段,经计算得出本PCR所需最低模板量为1.65ng。

图4 最低模板量实验结果

如 图5所示,18孔分别为:阴性标本、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、阳性标本、肺炎支原体、解脲支原体、人形支原体、Marker,按PCR扩增条件进行扩增后,只有4号孔(即阳性标本)在400至500bp之间出现条带,而其他各孔均未出现条带。

图5 特异性实验结果

三、PCR产物测序

PCR扩增产物测序结果为432bp,与GenBank中猪、牛、羊附红体16S rRNA基因序列进行比较,显示扩增产物与羊和牛附红体的同源性均为86.5%,与猪附红体的同源性为96.9%。

70

人TGGACGAAAG TCTGATGGAG CAATACCACG TGAACGATGA AGGTCTTCTG ATTGTAAAGT ACTTTTATTT

羊 ------ ------ ------ ----A- ------ ------ T------

猪 ------ ------ ------ ------ ------ ------ T------

牛 ------ ------ ------ ------ ------ ------ T------

140

人AGGAAAAAAT GCGCTACAGG AAATGGTGGC GCCCTGATTC TACTAATTGA ATAAGTGACA GCTATCTATG

羊 ----A ---GCT--- ---AGC-- --T---GG ----- ---- ---A----

猪 -----A ------ ----G-- ------C ----- ----- ---A----

牛 -----A ---GCT--- ----AGC-- ---T--GG ---- --- ---A----

210

人TGCCAGCACC TGCGGTAAAT CATAGGTCAC GAGCATTATC CGGATTTATT GGGCGTAATG GAAGCGTAGG

羊 -----G- ------A ------ A----- ------ ----A- ------

猪 -----G- ------A ------ ------ ------ ----A- ------

牛 -----G- ------A ------ ------ ------ ----A- ------

280

人CTGAAGTGTG TATCCATTGT TAAAAGTCCT TGCTTAACAA GTGTTCGCGG TGGAGATTAC ACTTCTAGAA

羊 -G-GGAG-CT G--- ---G-CAT- --C-- A--GT--A ----CT- CTCC---G

猪 ------ ----- -----A-- ------ ------ ------ -----

牛TG-GGAG-T- G----- ---G-CAT- ----- A--GT--A ---CGC CTCC--G

350

人TTAGTTAGAG GGCACTGGAA TTCAATGTGT AGTGGTGGAA AACGTAGATA TATTGAGGAA CCACCGGAGC

羊 ---A----G- --T-------- --C---- TG------- -AC-A-AG--

猪 ------ ------ ------ ------ T----- ----- --------

牛 ---A----G- --T---- ---- --C---- TG--- ---- -AT-A-AG--

420

人TAAAGCGAGT GCCTGGGACA TAATTGACGC TGAGGCTTGA AAGCGTGGGA AGCAAATCGG ATTAGATACC

羊 ---G--- A----T- ---C--- ------ -----G ---G-- ------

猪 ---A--- ------ ------ ------ -----T ----G-- ------

牛 ---G--- --A---T- --CC--A- ----- -----G ----G-- -----

432

人CCAGTAGTCC AC

羊 ----- --

猪 ----- --

牛 ----- --

讨论

附红细胞体病是由附红细胞体寄生于多种动物和人的红细胞表面、血浆及骨髓中,引起发热、贫血、黄疸等临床表现的一种人兽共患传染病,按其主要特征应属于血液病。附红体最早被发现要追溯到1928年,当年Schilling和Dingen等几乎同时分别在啮齿类动物中查到类球状血虫体(E.coccoides)。其后人们又陆续在猪、牛、羊等动物体内发现附红体[ 1]。而直到1986年,Puntraic等[ 13]才正式描述了人类的附红体病。而我国对此病的研究较晚,直至1981年以后才相继报道在畜、禽中发现附红体病。1991年,内蒙自治区邰秀珍等[ 13]在国内首次报告人的附红体病病例;1992年,冯立明、裴标等[ 3, 4]又先后报道了人附红体病。1993年,我国在卫生部的关注下,组成了附红体病调查组,由尚德秋等[ 57]对此病进行了系列的流行病学研究,并证实了附红体病在人群中的感染。虽然人附红细胞体病发现较晚,但是近来越来越多的报道显示人感染附红体有递增的趋势,近年大量流行病学调查表明本病在我国并非罕见[ 1417],但发现病例不多,其主要原因[ 10]是过去临床医生对本病认识不足,在临床表现上与感冒、疟疾、贫血等疾病易相混淆,医疗单位又缺乏特异的实验诊断手段,致使病例不易被发现,因此如何能够快速、准确地检测附红体感染尤为重要。目前检测附红体的方法有染色镜检、光镜观察[ 18]、生物学检查、免疫学检查、分子生物学技术等[ 19]。本课题选取了瑞氏-吉姆萨染色镜检、吖啶橙荧光染色检查、PCR这三种最常用的方法进行研究,比较各方法之间的优缺点,同时比较了不同人群之间附红体感染率是否存在差异。

瑞氏-吉姆萨染色镜检法具有操作简便、快速等优点,已被广泛运用于附红体的筛查。但是其缺点也很明显,由于附红体形态多样、染色过程中影响因素较多,如红细胞变形、染色剂附着在红细胞上、贫血造成的棘形红细胞、锯齿形红细胞增多等现象均可导致出现假阳性[ 2022]。同时,我们在实验过程中发现,在许多血片中,在红细胞平铺的地方未能找到附红体,然而在血片头部红细胞聚集的地方却能观察到较多的附红体,出现此现象的原因尚不清楚,亦有可能为假阳性,具体原因需要进一步研究查明,本实验中出现此类现象均按阳性处理。

吖啶橙荧光染色法作为检测附红细胞体病常用的方法之一,很好地弥补了瑞氏-吉姆萨染色法的缺点,准确率较高,但是由于吖啶橙荧光染色针对的是DNA以及RNA,因此所有含有DNA或RNA的细胞均会对检测造成影响,所以当外周血中出现网织红细胞以及豪焦小体等物质时,此法也会出现假阳性,但是这种情况出现的概率较小,所以假阳性率也较低。

目前国内外对于使用分子诊断方法检测附红体病的研究主要集中在猪、牛、羊等动物上,鲜有使用分子诊断方法检测人附红体病的相关研究报道,我们先参考相关文献中所描述的方法进行PCR,然而,实验结果显示使用该方法无法得到特异性产物。因此,我们根据GenBank中已收录的猪、牛、羊、猫、鼠等5种附红细胞体的16S rRNA基因序列设计1对特异性引物,初步建立了人附红体病的分子诊断方法。实验结果显示,此方法能扩增出特异性产物,同时,在使用大肠杆菌、肺炎支原体、解脲支原体、金黄色葡萄球菌、人形支原体进行的特异性实验结果显示,此方法特异性较高。然而,此方法仍然存在很多不完善的地方需要改进。首先,目前已知附红体种类有10余种,而目前GenBank中只收录了猪、牛、羊、猫、鼠5种动物附红体的基因序列,所以本实验中所设计的引物仅仅是针对此5种附红体,无法涵盖所有其他附红体种。因此,在检测过程中可能出现假阴性。其次,在处理标本,纯化附红体时,由于震荡不充分或离心力不够可能会导致大量附红体丢失,同时抽提DNA的过程中也有可能丢失部分DNA,造成最后所得模板DNA浓度低于最低检出限,导致结果出现假阴性。这些问题都需要做更进一步的研究将其解决。

从 表1可见,在体检组、白血病组以及肾移植组瑞氏-吉姆萨染色所得附红体阳性率均高于吖啶橙荧光染色所得结果,同时,研究显示吖啶橙染色法在检测附红体病原学上是非常有效的,而瑞氏-吉姆萨染色法特异性低,说明瑞氏-吉姆萨染色法假阳性率相对较高,吖啶橙荧光染色法更适合作为临床诊断人附红体病的检测方法[ 23]。

表1 瑞氏-吉姆萨染色和吖啶橙荧光染色检测结果

在 表1中,以吖啶橙荧光染色结果为参考,体检组阳性率为24%,白血病组阳性率为62%,肾移植组为68%,从这一组数据中可知,免疫力低下人群比健康人群更容易感染附红体,另一方面,虽然体检组有部分人感染附红体,但并没有表现出临床症状,说明附红体为“条件致病菌”,只有在免疫力低下或在附红体感染超过一定数量时才会表现出临床症状。因此,健康人群中也有部分附红体携带者。

从三种方法的比较中可知,瑞氏-吉姆萨染色法虽然操作简便易行,但是准确率太低,同时分子诊断技术步骤繁琐、耗时长,而且此方法目前尚不完善,需要更进一步研究加以解决,由于人附红体基因序列尚不明确,作为“金标准”的基因测序无法进行,所以吖啶橙荧光染色法是目前临床诊断附红体病的比较好的方法。同时,实验结果证实了免疫力低下人群比健康人群更容易感染附红体。

The authors have declared that no competing interests exist.

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