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沈敏娜, 吴炯, 郭玮, 张春燕, 宋斌斌, 王蓓丽, 汪洋, 潘柏申. M蛋白干扰对血清样本常规生化检测项目的影响. 2011, 26(11): 730-735
SHEN Minna, WU Jiong, GUO Wei, ZHANG Chunyan, SONG Binbin, WANG Beili, WANG Yang, PAN Baishen. The influence of M protein interference on the routine biochemical assays of serum samples. Labratory Medicine, 2011, 26(11): 730-735  
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M蛋白干扰对血清样本常规生化检测项目的影响
沈敏娜, 吴炯, 郭玮, 张春燕, 宋斌斌, 王蓓丽, 汪洋, 潘柏申
复旦大学附属中山医院检验科,上海 200032

通讯作者:潘柏申,联系电话:021-64041990-2376

作者简介:沈敏娜,女,1986年生,学士,技师,主要从事临床生化工作。

摘要
目的

全面评估单克隆蛋白(M蛋白)对24项常规生化检测项目的影响以及可能存在的潜在干扰。建立适用于临床实验室鉴别、验证进而去除M蛋白干扰的可操作流程。

方法

观察57例M蛋白阳性样本的检测反应曲线,鉴别出可疑M蛋白干扰样本,再通过强生Vitros 5.1 FS干式生化分析仪的检测结果验证M蛋白干扰。使用生理盐水稀释M蛋白干扰样本,去除干扰。采用手工方法模拟高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)检测,探讨M蛋白干扰产生的可能原因。

结果

57例样本(M蛋白浓度为2.0~71.4 g/L)中有50例样本(87.7%)24项常规生化检测项目未见明显干扰;7例样本(12.3%)22项常规生化检测项目无明显干扰,有2项检测存在M蛋白干扰,其中6例C反应蛋白(CRP)结果出现假性降低,1例HDL-C结果出现负值。M蛋白干扰引起的CRP结果假性下降程度与CRP浓度相关,与M蛋白浓度无关,实际CRP值越高,M蛋白引起的负干扰越严重。M蛋白干扰出现的频率与M蛋白浓度和类型相关,M蛋白浓度越高,出现干扰的频率越高,干扰常见于IgG λ和 κ型M蛋白。干扰样本稀释后,可基本去除M蛋白的影响。

结论

在24项常规生化检测项目中,M蛋白干扰可见于CRP、HDL-C检测。可通过稀释作用去除M蛋白干扰,或使用干化学方法复检M蛋白干扰样本,以得到可信结果。

关键词: M蛋白; 干扰; 干化学; 高密度脂蛋白胆固醇; C反应蛋白
中图分类号:R446.1 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2011)011-0730-06
The influence of M protein interference on the routine biochemical assays of serum samples
SHEN Minna, WU Jiong, GUO Wei, ZHANG Chunyan, SONG Binbin, WANG Beili, WANG Yang, PAN Baishen
Department of Clinical Laboratory,Zhongshan Hospital of Fudan University,Shanghai 200032,China
Abstract
Objective

To investigate the influence and potential interference of monoclonal protein (M protein) on 24 routine biochemical assays, and establish the operational processes for clinical laboratory to identify, confirm and remove the interference of M protein.

Methods

The reaction absorbance curves of 57 M protein positive serum samples were observed. According to the reaction absorbance curves, the suspected samples interfered by M protein were identified. Furthermore, the interference of M protein was confirmed by dry chemical method (Johnson Vitros 5.1 FS automatic biochemical analyzer). The samples interfered by M protein were diluted by normal saline to remove the interference. The high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) assay was performed manually to explore the causes of M protein interference.

Results

A total of 50 (87.7%) of 57 samples (M protein concentration: 2.0-71.4 g/L) did not show any interference. M protein interference occurred not obviously in 7 (12.3%) samples, and there were M protein interferences in 2 of the 24 routine biochemical assays. The levels of C reactive protein (CRP) decreased falsely in 6 samples, and there was negative result of HDL-C in 1 sample. The false decreasing of CRP caused by M protein interference was correlated with CRP concentration rather than M protein concentration. In other words, the higher the actual value of CRP was, the severer the M protein negatively interfered. The frequency of the M protein interference was correlated with the concentration and type of M protein. In other words, the higher the M protein concentration was, the higher the frequency of the interference occurred. M protein interference was commonly caused by IgG λ and κ. After diluting the interfered samples, the M protein interference can be removed.

Conclusions

In the 24 routine biochemical assays, M protein interference occurs relatively in CRP and HDL-C assays. M protein interference can be removed via diluting its concentration or retesting with dry chemical method to obtain the reliable results.

Keyword: Monoclonal protein; Interference; Dry chemical; High-density lipoprotein cholesterol; C reactive protein

单克隆蛋白(M蛋白)在单克隆丙种球蛋白病患者血清中异常增多,其理化性质十分均一,多无免疫活性,又称副蛋白。M蛋白可以是IgG、IgM、IgA、IgE或IgD,也可以是κ或λ轻链中的任何一型。M蛋白多见于恶性单克隆丙种球蛋白血症、继发性单克隆丙种球蛋白血症、良性M蛋白血症等。近年来,已有多篇文献报道M蛋白在生化检测中存在干扰,涉及不同样本(血清或血浆)、不同仪器以及不同检测方法。已有报道的干扰项目包括血清钠(Na)[ 1]、钙(Ca)[ 1]、磷(P)[ 2]、C反应蛋白(CRP)[ 3, 4]、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)[ 4~ 6]、胆红素[ 5, 6]和血浆葡萄糖(Glu)[ 4, 7]、γ-谷氨酰基转移酶(GGT)[ 7]等。但到目前为止,M蛋白对常规生化检测项目的影响,国内尚无全面评估,国外也仅限个别项目。由于多种原因,临床实验室尚未充分重视M蛋白可能存在的潜在干扰,更缺乏鉴别、验证进而去除M蛋白干扰的可操作流程。为此,我们尝试评估M蛋白对常规生化检测项目的影响,建立适用于临床实验室鉴别、验证和去除M蛋白干扰的可操作方法。

材料和方法
一、研究对象

选取2011年1月至4月复旦大学附属中山医院经血清蛋白电泳和免疫固定电泳检测确定存在M蛋白的血清样本57例。所有血清样本经HITACHI 7600全自动生化分析仪常规指数检测不存在溶血和脂血。57例样本除2例来源于同一患者不同采血时间外,其余55例样本均来源于不同患者。血清样本收集后保存于-20 ℃直至检测,仅冻融1次。

二、仪器与试剂

总胆红素(TBil)、直接胆红素(DBil)试剂盒由日本和光纯药工业株式会社提供,间接离子选择电极法(ISE)内部标准液、稀释液、参比电极液和Na、钾(K)、氯(Cl)电极、参比电极由日本HITACHI公司提供,总蛋白(TP)、白蛋白(Alb)、尿酸(UA)、肌酐(Cr)、Ca、P、镁(Mg)、淀粉酶(AMY)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)试剂盒由瑞士罗氏公司提供,尿素氮(BUN)、二氧化碳(CO2)、CRP试剂盒由德国德赛诊断公司提供,天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(AKP)、乳酸脱氢酶(LDH)、GGT由上海科华生物工程股份有限公司提供,HDL-C试剂盒由日本协和药业株式会社提供,以上24项常规生化检测在日本日立公司HITACHI 7600全自动生化分析仪(简称HITACHI 7600)上完成。

Vitros 5.1 FS干式生化分析仪(简称Vitros 5.1 FS,美国强生公司)参考液、TBil、结合及非结合胆红素、TP、Alb、AST、ALT、AKP、LDH、GGT、BUN、UA、Cr、CO2、Ca、P、Mg、AMY、CK、CK-MB、CRP、HDL-C测定干片由美国强生公司提供,以上干片检测在Vitros 5.1 FS上完成。

免疫固定电泳试剂盒和免疫固定电泳抗体试剂盒由法国Sebia公司提供,血清蛋白电泳和免疫固定电泳分别在CAPILLARYS 2毛细管电泳仪和Hydrasys LC琼脂糖凝胶电泳仪(法国Sebia公司)上完成。

三、方法

1.M蛋白浓度检测及分型 使用HITACHI 7600检测所有样本TP浓度,通过血清蛋白电泳确定M蛋白比例,两者相乘即为M蛋白浓度。再通过免疫固定电泳确定M蛋白类型。

2.干化学方法抗M蛋白干扰的验证 观察干扰样本稀释前HITACHI 7600、Vitros 5.1 FS的检测结果,与稀释后的检测结果比较,验证Vitros 5.1 FS(干化学法)抗M蛋白干扰能力。

3.M蛋白干扰的鉴别 观察所有M蛋白阳性样本HITACHI 7600检测时反应监测系统显示的TBil、DBil、TP、Alb、AST、ALT、AKP、LDH、GGT、BUN、UA、Cr、CO2、Ca、P、Mg、AMY、CK、CK-MB、CRP、HDL-C反应曲线,对照各自高、低值的正常反应曲线,鉴别出异常反应曲线,作为可疑的M蛋白干扰样本。Na、K、Cl检测采用间接离子选择电极法,无反应曲线,使用Vitros 5.1 FS同步检测,比较两者结果,进行相关性分析和配对 t检验以鉴别M蛋白干扰。

4.M蛋白干扰的验证 所有可疑的M蛋白干扰样本再通过Vitros 5.1 FS的检测结果进行验证。结果一致,排除M蛋白干扰;结果不一致,证实为M蛋白干扰。

5.去除M蛋白干扰的方法 可疑M蛋白干扰样本使用生理盐水稀释,稀释比例CRP为1∶10、HDL-C为1∶5。比较稀释前、后和Vitros 5.1 FS的检测结果,以判断稀释作用去除M蛋白干扰的效果。

6.探讨M蛋白干扰产生的原因 按照厂商的实验方案,试剂和样本用量扩大10倍,在试管中手工进行HITACHI 7600 HDL-C试验,同时检测高、低值对照和可疑M蛋白干扰样本。探讨M蛋白干扰产生的原因。

四、统计学方法

采用SPSS 17.0 软件和Microsoft Excel进行统计学分析。HITACHI 7600与Vitros 5.1 FS结果间的相关性使用相关性分析,结果间差异使用配对 t检验。

结果
一、M蛋白浓度及类型

57例血清样本M蛋白浓度2.0~71.4 g/L,平均为20.3 g/L。M蛋白类型包括IgG λ(42.1%)、IgG κ(28.1%)、IgA λ(19.3%)、IgA κ(3.5%)、IgM λ(3.5%)和IgM κ(3.5%)。

二、鉴别出的M蛋白干扰

观察57例M蛋白阳性样本HITACHI 7600 上21项常规生化检测项目的反应曲线。其中6例样本CRP检测出现异常反应曲线。见 图1;1例样本HDL-C检测出现异常反应曲线。见 图2;其余共计1361项次检测的反应曲线未见异常。HITACHI 7600的 Na、K、Cl检测结果与Vitros 5.1 FS的相关性较好( r=0.792, t=-0.286, P>0.05),两者差异无统计学意义。

图1 HITACHI 7600 CRP检测吸光度曲线注:(a)低值对照;(b)高值对照;(c)M蛋白干扰;灰色区域内为计算测量点

图2 HITACHI 7600 HDL-C检测吸光度曲线注:(a)高值对照;(b)低值对照;(c)M蛋白干扰;灰色区域内为计算测量点

三、M蛋白干扰的验证结果

经Vitros 5.1 FS验证,57例样本中有50例样本(87.7%)24项常规生化检测无干扰;7例样本(12.3%)22项常规生化检测无干扰,2项检测存在M蛋白干扰,其中6例CRP结果出现假性降低,1例HDL-C出现负值。

四、干化学法抗M蛋白干扰的验证结果

7例CRP或HDL-C检测结果异常的干扰样本稀释前HITACHI 7600与Vitros 5.1 FS的检测结果差异达1.2~9.4倍,稀释后HITACHI 7600的检测结果与Vitros 5.1 FS相关性较好( r=0.837)。见 表1。

表1 7例干扰样本稀释前、后结果比较
五、干扰频率与M蛋白浓度和类型的关系

M蛋白干扰出现的频率与M蛋白浓度和类型有关。M蛋白浓度<40 g/L的49例样本中仅4例(8.2%)出现异常结果;M蛋白浓度≥40 g/L的8例样本中有3例(37.5%)出现异常结果。见 图3。仅在含IgG λ和IgG κ型M蛋白的血清样本中观察到干扰现象,干扰比例分别为16.7%和18.8%。

图3 57例样本M蛋白浓度分布及干扰注:空心圈代表无M蛋白干扰样本;实心圈代表存在M蛋白干扰样本

六、M蛋白对CRP的负干扰程度与CRP和M蛋白浓度的关系

M蛋白干扰引起的CRP结果假性下降程度与CRP浓度有一定关联,与M蛋白浓度无明显相关性。M蛋白干扰引起的CRP结果假性下降程度随CRP浓度的升高而增大,当CRP浓度达到120 mg/L以后,CRP结果假性下降程度不再无限制增大,而是维持在85%左右。见 图4。

图4 M蛋白干扰引起的CRP结果假性下降程度与M蛋白和CRP浓度的相关性

七、稀释作用去除M蛋白干扰的效果

稀释作用可消除M蛋白干扰。6例CRP M蛋白干扰样本稀释前反应曲线异常,检测结果为15.69~42.99 mg/L;稀释后反应曲线无异常,近似高值对照[ 图1(b)],检测结果为49.6~162.78 mg/L。1例HDL-C M蛋白干扰样本稀释前反应曲线异常,检测结果为负值;稀释后反应曲线无异常,近似低值对照[ 图2(b)]。7例干扰样本稀释后的检测结果与稀释前Vitros 5.1 FS检测结果的相关性好( r=0.837)。见 表1。

八、M蛋白干扰产生的原因

手工模拟HDL-C检测,进一步探讨M蛋白干扰产生的原因。所有手工检测样本无溶血、脂血、黄疸。加入试剂1(R1)后,R1成分与M蛋白发生沉淀反应,使干扰样本浊度明显高于高、低值对照;加入试剂2(R2)后,高值对照中的HDL-C组分使反应体系出现青紫色,而低值对照和干扰样本未出现青紫色。

讨论

本研究最初通过观察经免疫固定电泳确定存在M蛋白的57例血清样本(M蛋白浓度为2.0~71.4 g/L)HITACHI 7600的检测反应曲线,对照各自高、低值正常反应曲线,鉴别出可疑M蛋白干扰7例,再与Vitros 5.1 FS的检测结果进行比较。据文献报道,Vitros 950不存在M蛋白干扰[ 6],Vitros 5.1 FS与Vitros 950检测原理相同,使用相似类型的干片试剂,采用多涂层薄膜干片技术,共4层,样本到达反应层前必须先穿过扩散层,扩散层能均匀分布样本,同时过滤大分子,阻挡干扰物质。通过比较干扰样本稀释前、稀释后HITACHI 7600与Vitros 5.1 FS检测结果的差异,也证实了Vitros 5.1 FS抗M蛋白干扰的能力。因此使用采用干片技术检测的Vitros 5.1 FS验证M蛋白干扰。

本研究全面评估了M蛋白对24项生化检测项目的影响,包括:TBil、DBil、TP、Alb、AST、ALT、AKP、LDH、γ-GT、BUN、UA、Cr、Na、K、Cl、CO2、Ca、P、Mg、AMY、CK、CK-MB、CRP和HDL-C。但仅在CRP和HDL-C检测中发现干扰,与文献报道存在差异,这可能归因于仪器性能、试剂组分和样本保存的不同。据我们所知,尚无关于HITACHI 7600出现M蛋白干扰的报道。虽然项目相同,但国外文献中使用的仪器和试剂与我们在研究中使用的不同,而M蛋白干扰与仪器性能、试剂组分相关[ 6],因此,我们得到不同的结果。多篇文献报道胆红素检测存在M蛋白干扰[ 5, 6],但本研究在HITACHI 7600 TBil和DBil检测中并未观察到任何干扰现象。这可能归因于我们的样本保存方式,样本收集的时间跨度达4个月,为减少批间差,所有样本统一保存于-20 ℃直至检测。但胆红素不稳定,见光分解,即使在避光条件下,胆红素也会不断降解。由于样本保存时间过长,本研究关于胆红素M蛋白干扰的结果可能与使用新鲜样本即时检测的实验情况有一定不同。

本研究发现,49例M蛋白浓度<40 g/L的样本中,仅4例(8.2%)存在干扰;而8例M蛋白浓度≥40 g/L的样本中,有3例(37.5%)存在干扰。7例干扰样本的M蛋白浓度均值(32.6 g/L)高于50例无干扰样本的M蛋白浓度均值(18.6 g/L)。在57例样本中,本研究仅在含IgG λ型和IgG κ型M蛋白样本中观察到干扰现象。可见,M蛋白干扰出现的频率与M蛋白浓度和类型相关。这与Yang等[ 6]报道的结果一致,而与Roy等[ 1]报道的结果不一致。今后的研究可进一步扩大样本量,以验证这一结果。

本研究发现M蛋白干扰引起的CRP结果假性下降程度与M蛋白本身的浓度无关,而与CRP浓度密切相关。当CRP浓度低于120 mg/L时,其结果假性下降程度与CRP浓度正相关;而当CRP浓度达到120 mg/L以上时,其结果假性下降程度进入平台期,基本维持在85%左右。即在实验室日常检测中,实际CRP结果越高,潜在M蛋白干扰影响越大。CRP是一种急性时相反应蛋白,可用于鉴别感染类型、炎症病变类型和程度。本研究7例干扰样本中,CRP结果假性下降程度最高达89.4% (稀释后CRP浓度为154.6 mg/L,而原倍浓度仅为16.4 mg/L)。这样的错误结果很可能严重误导临床,造成不良后果。因此,除重视传统的3种主要干扰因素(溶血、脂血、黄疸)外,临床实验室也应重视M蛋白可能存在的潜在干扰。

本研究通过手工方法,扩大试剂、样本用量,模拟HITACHI 7600检测HDL-C的全过程。HDL-C检测原理为化学修饰酶法,首先通过第1反应,将样本中除HDL以外的LDL、VLDL和乳糜微粒(CM)等通过葡聚糖硫酸和镁盐凝结。在第2反应中,通过化学修饰的胆固醇酯酶加水分解HDL中所含的酯酶型胆固醇,生成游离型胆固醇,通过胆固醇氧化酶作用,生成过氧化氢,使氨基安替比林氧化缩合生成青紫色苯醌色素。在第1反应中,干扰样本浊度明显高于高、低值对照,可见R1中的某些成分可能引起了M蛋白的沉淀。在第2反应中,干扰样本并未像高值样本那样出现青紫色,可见干扰样本中可参与反应的HDL-C浓度相当低,Vitros 5.1 FS的结果也验证了这一点。分析HITACHI 7600反应曲线发现,第1反应时,基线吸光度过高,加入R2后,可能由于稀释作用,吸光度下降,导致仪器计算结果为负值,见 图2(c)。相比CRP,这样的错误结果更易鉴别。

有文献报道,M蛋白干扰源于M蛋白与检测试剂内某些抗人抗体反应,发生沉淀,引起浊度增加,通过去除M蛋白或稀释的方法去除干扰[ 4]。Yu等[ 3]将血清与抗人IgM抗体一起孵育,沉淀所有IgM,去除IgM λ型M蛋白,成功去除了CRP检测中的M蛋白干扰[ 3]。但这种去除M蛋白的方法较为繁琐,并不适用于临床常规检测工作。本研究使用生理盐水稀释7例M蛋白干扰样本,均得到较理想结果。相比Yu等[ 3]的方法,虽然无法完全去除M蛋白干扰,但本方法更适用于临床常规检验部门,尤其是大样本量实验室。当然,在有条件的实验室,也可以通过抗干扰能力较强的其他方法验证可疑结果。

本研究首次全面评估了M蛋白对血清样本生化检测项目的干扰。有文献报道,肝素锂抗凝血浆样本的部分项目检测也存在M蛋白干扰,肝素和血浆蛋白结合生产复合物,影响浊度,干扰检测,例如Glu和GGT[ 7]。血常规检测中的血细胞计数[ 1]、血红蛋白(Hb)[ 8]和免疫检测中的促甲状腺激素(TSH)[ 9]也有报道存在M蛋白干扰。我们可以在今后的研究中逐步验证,综合评估M蛋白对常规检测项目可能存在的潜在影响,尽可能减少由M蛋白干扰引起的实验室误差以及由此造成的临床不良影响。

The authors have declared that no competing interests exist.

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