引用本文
苏洁, 张博, 熊新, 王丽娜, 吴婕, 白妤娥, 穆豪放, 李建平, 杨树栋, 邓亚军. 优化甲醛固定石蜡包埋组织DNA提取预处理对STR分型有效性的研究. 25(8): 628-631
SU Jie, ZHANG Bo, XIONG Xin, WANG Lina, WU Jie, BAI Yu'e, MU Haofang, LI Jianping, YANG Shudong, DENG Yajun. Study on the improvement of DNA pre-extraction from formaldehyde-fixed and paraffin-embedded tissues for the STR typing availability. Labratory Medicine, 25(8): 628-631  
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优化甲醛固定石蜡包埋组织DNA提取预处理对STR分型有效性的研究
苏洁, 张博, 熊新, 王丽娜, 吴婕, 白妤娥, 穆豪放, 李建平, 杨树栋, 邓亚军
华大方瑞司法物证鉴定中心,北京 101318

作者简介：苏洁,女,1982年生,硕士,研究实习员,主要从事DNA鉴定研究。

摘要
目的

通过对甲醛固定石蜡包埋组织(FFPET)DNA提取进行优化处理,确定满足FFPET样本进行短片段重复序列(STR)完整分型的条件。

方法

改变石蜡切片厚度、离心速率和时间、组织用量和消化液体积等参数提取FFPET DNA,并对提取的DNA样本进行常规STR扩增检验。

结果

优化方法处理后可以提取到较高质量DNA(1 000 bp),经扩增均可以检出性别基因座(amelogenin)和15个以上STR基因座。

结论

FFPET优化方法能够提高DNA提取的质量,适合STR分型研究。

关键词: DNA提取; 甲醛固定石蜡包埋组织; STR分型
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)08-0628-04
Study on the improvement of DNA pre-extraction from formaldehyde-fixed and paraffin-embedded tissues for the STR typing availability
SU Jie, ZHANG Bo, XIONG Xin, WANG Lina, WU Jie, BAI Yu'e, MU Haofang, LI Jianping, YANG Shudong, DENG Yajun
Center of Forensic Sciences, Beijing Genomics Institute,Beijing 101318, China
Abstract
Objective

To confirm the available condition that formaldehyde-fixed and paraffin-embedded tissues (FFPET) meets the request of the short tandem repeat (STR) typing through the improvement of DNA pre-extraction from the FFPET.

Methods

By changing conditions such as the thickness of the slice, the speed and time of centrifugation, the quantity of sample and volume of digestion buffer, the DNA from FFPET was extracted and amplified,then the STR typing of the DNA samples was tested.

Results

The optimized method could give higher quality of DNA (1 000 bp). The Amelogenin locus and more than 15 STR loci of the FFPET samples were whole detected.

Conclusions

The optimized method can improve the quality of DNA from FFPET and be suitable for the STR typing study.

Keyword: DNA extraction; Formaldehyde-fixed and paraffin-embedded tissue; STR typing

目前博物馆和病理科研究室收集的各种基因材料文档, 甲醛固定石蜡包埋组织(formalin-fixed and paraffin-embedded tissues, FFPET)在档案性材料中占有很大比例[1]。在研究人类学、疾病学和民事医疗纠纷案例审判时, 为识别个体, 常需要对FFPET提取DNA进行短片段重复序列(short tandem repeats, STR)分型或同一认定。

甲醛作为生物标本的保存液有渗透力强、防腐杀菌效果好、固定速度快等优点, 但甲醛同时会引起蛋白、DNA等大分子之间相互交联, 当溶液pH值低于1时, DNA会在无缓冲溶液中直接降解成小片段[1]。经过甲醛固定超过5 d的组织, 核DNA一般都会出现降解, 提取结果经常是DNA片段短、产物少、抑制物多, 聚合酶链反应(PCR)受上述因素影响不能继续进行相关研究。经甲醛固定的组织脱水、透明(< 5 d)被包埋成蜡块, 在高温包埋时, DNA形成单链极易断裂。另外, 石蜡化学性质稳定, 会干扰DNA聚合酶活性而抑制PCR反应, 因此常规FFPET提取DNA不能满足后续研究的需要。

如果预处理能够充分去除石蜡, 打开大分子之间的交联, 将蛋白完全消化可以得到质量较好的DNA模板。现已报道多种FFPET核酸提取的改进方法都涉及多个调整因素 [2, 3], 没有具体的优化办法。为了提高FFPET核酸提取成功率, 我们通过实验研究并结合已发表的文献, 改变石蜡切片厚度、离心速率和时间、组织用量和消化液体积等参数优化FFPET核酸提取方法, 获得了较好质量的DNA。

材料和方法
一、检材

本中心收到的委托鉴定FFPET样本5例, 都经甲醛固定石蜡包埋, 样本保存期为112个月, 检材信息见表1。

表1 本研究检材信息
二、试剂

QIAamp DNA FFPE Tissue Kit, Sinofiler系统, Identifiler系统, PowerPlex16和AGCU 17+1系统荧光复合扩增试剂盒。

三、预处理

1.优化方法 去除蜡块表面石蜡, 将组织切成1 mm切片, 取1片置于1.5 mL离心管中。向离心管中加入1 mL二甲苯, 37 ℃水浴20 min, 8 000 r/min(离心半径8.5 cm)离心20 min, 重复脱蜡2次, 离心时间分别缩短至10和5 min。脱蜡后样本用无水乙醇快速冲洗3次。将组织在无水乙醇中浸泡24 h, 然后室温下自然晾干。取米粒大小的组织放入1.5 mL 离心管中, 加入消化液100 μ L, 20 mg/mL 蛋白酶K(PK)20 μ L, 56 ℃消化至组织完全溶解。

2.常规方法 将蜡块组织切成10 μ m切片, 取1片置于1.5 mL离心管中。向离心管中加入1 mL二甲苯, 37 ℃水浴20 min, 13 000 r/min(离心半径8.5 cm)离心20 min, 重复脱蜡2次。脱蜡后组织在无水乙醇中浸泡24 h, 然后室温下自然晾干。取全部组织放入1.5 mL 离心管中, 加入消化液200 μ L, 20 mg/mL PK 20μ L, 56 ℃消化至组织完全溶解。

四、DNA提取和纯化

采用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit提取纯化。

五、DNA检测

取DNA提取物5 μ L, 经2%琼脂糖凝胶电泳检测。

六、PCR扩增

采用Sinofiler系统荧光复合扩增检材1, Identifiler系统荧光复合扩增检材2, AGCU 17+1系统荧光复合扩增检材3和5, PowerPlex16系统荧光复合扩增检材4。

七、STR分型

1 μ L PCR产物与9 μ L甲酰胺、0.1 μ L内标混合, 经ABI 3130XL测序仪电泳荧光检测, 使用Genemapper软件分析基因分型结果。

结 果

经2%琼脂糖电泳, 检材1和2采用优化方法均提取到1 000 bp以上片段, 检材3、4、5提取到约250 bp以上片段, 提取DNA产物呈弥散带, 采用常规方法均未提取到DNA(图1)。

图1 DNA提取物鉴定

采用优化方法, 保存1个月的检材1和2经甲醛固定石蜡包埋能够检出完整的STR分型, 与比对样本比较, 两者分型相同。常规方法检材1未检出STR分型, 检材2检出性别基因座, 且峰值低于100相对荧光单位, 不能判断STR分型(图2~3)。保存1年的检材3、4、5经过甲醛固定石蜡包埋, 电泳能够检出完整的STR分型, 且检测峰值均大于200相对荧光单位。各检材STR检测数据见表2。

图2 T62样本和比对样本峰型图

图3 T249样本和比对样本峰型图

表2 检材STR检测数据
讨 论

生物细胞经甲醛固定后由于DNA被甲基化以单链存在, 失去双链结合的氢键, 仅由相邻碱基间磷酸键连接, 高温包埋和提取振动时DNA容易随机降解。因此从FFPET中提取到400 bp以上的核酸十分困难。本研究发现提取FFPET核酸关键在于预处理, 要减轻外力对DNA链内键的剪切, 保证DNA单链不受损伤, 可以得到较好的DNA模板, 满足STR分型, 应用于法医物证同一认定。

提取FFPET核酸的方法已有报道[4~6], 本研究的优化方法涉及4个方面:首先, 样本切片厚度增加到1 mm, 远超过文献所述的10 μ m[3], 结果表明二甲苯可以渗透该厚度置换石蜡。切片增厚不仅降低操作难度, 而且使蛋白、纤维等支持介质增多, DNA不易断裂。其次, 脱蜡时降低离心速率、缩减离心时间, 能够降低旋转对DNA的剪切, 保证DNA单链长度在400 bp以上。再次, 脱腊后快速用无水乙醇反复冲洗去除二甲苯, 避免了组织中二甲苯再渗透降解DNA。最后, 用于消化的组织要足够小, 否则DNA长期浸泡在消化液中会被组织释放的核酸酶降解。

本研究对FFPET处理方法优化, 并将优化方法应用于保存期1年以内的5例检材都成功提取到DNA, 采用不同的扩增系统得到完整的STR分型, 说明经甲醛固定少于5 d的组织被封闭在石蜡中, 受温度、湿度、紫外线等影响小, DNA保持相对完整。因此, 在预处理方法得当的情况下, 档案性基因材料按照常规扩增方法也能够提供完整的基因信息。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Gilbert MP, Haselkorn T, Bance M, et al. The isolation of nucleic acids from fixed, paraffin embedded tissues-which methods are useful when?[J]. PLoS One, 2007, 2(6): e537. [本文引用:2] [JCR: 3.73]
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