引用本文
张一兵, 张淑芹, 周文兴, 罗喜钢. 鸟嘌呤脱氨酶速率法测定及其对肝病的诊断价值. 25(8): 625-627
ZHANG Yibing, ZHANG Shuqin, ZHOU Wenxing, LUO Xigang. Determination of guanine deaminase by rate method and its diagnostic value to liver diseases. Labratory Medicine, 25(8): 625-627  
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鸟嘌呤脱氨酶速率法测定及其对肝病的诊断价值
张一兵1, 张淑芹2, 周文兴2, 罗喜钢1
1. 辽宁医学院附属第三医院检验科,辽宁 锦州 121001
2. 辽宁医学院附属第一医院检验科,辽宁 锦州 121001

作者简介：张一兵,男,1961年生,硕士,主任技师,主要从事体液酶学研究。

基金:辽宁省教育厅科研课题(20072107)
摘要
目的

通过速率法测定鸟嘌呤脱氨酶(GD)活性,探讨GD活性对肝病的特异性诊断意义。

方法

利用GD催化鸟嘌呤生成黄嘌呤,偶联黄嘌呤氧化酶(XOD)生成H2O2,经过氧化物酶(POD)作用与4-氨基安替比林(4-AAP)及2,4-二氯酚作用生成醌亚胺化合物,从而建立测定GD活性的速率测定法。

结果

该方法重复性良好,批内度异系数( CV)为2.53%,批间 CV为3.57%。最适pH值为7.0,Km=1.09×10-2 mmol/L。线性在13.50 U/L以下。健康人GD活性呈偏态分布,第95百分位数(P95)<1.08 U/L。急性黄疸型肝炎和继发性肝癌患者GD活性明显增高,其阳性率分别98%和96%。

结论

该方法快速,精密度高,适用于自动生化分析仪,使GD能成为临床常规测定项目。GD活性增高对肝实质细胞性急性损害有较高的特异性诊断价值,优于丙氨酸氨基转移酶(ALT)等肝功能酶项目测定。

关键词: 鸟嘌呤脱氨酶; 速率法; 肝病
中图分类号:Q557 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)08-0625-03
Determination of guanine deaminase by rate method and its diagnostic value to liver diseases
ZHANG Yibing1, ZHANG Shuqin2, ZHOU Wenxing2, LUO Xigang1
1. Department of Clinical Laboratory, the Third Affiliated Hospital of Liaoning Medical College, Liaoning Jinzhou 121001, China
2. Department of Clinical Laboratory, the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical College, Liaoning Jinzhou 121001, China
Abstract
Objective

To determine the activity of guanine deaminase (GD) by rate method and investigate the specificity diagnostic value of GD activity in liver diseases.

Methods

Xanthine was obtained through the catalysis of guanine by GD. H2O2 was formed by the couple of xanthine oxidase (XOD). The actions of peroxidase (POD) and 4-aminoantipyrine (4-AAP) and 2, 4-dichlorophen producted quinone imine. The rate method of determining GD activity was established.

Results

The reproducibility of the method was good. The between-run and within-run coefficients of variation ( CV) were 3.57% and 2.53%, respectively. The optimal pH was 7.0. The Km was 1.09×10-2 mmol/L. The linear range was below 13.50 U/L. The activity of GD in healthy subjects was skew distribution, which the 95th percentile (P95) was< 1.08 U/L .The activities of GD in the patients with acute icteric hepatitis and secondary liver carcinoma increased significantly. The positive rates were 98% and 96%, respectively.

Conclusions

This method is rapid and accurate. It is suitable for automatic biochemical analyzers. The determination of GD can become a clinical routine item. The specificity of GD for liver parenchyma cellular acute lesion is better than that of other indicators, like alanine aminotransferase (ALT).

Keyword: Guanine deaminase; Rate method; Liver disease

鸟嘌呤脱氨酶(guanine deaminase, GD, EC3.5.4.3)在人体内主要存在于肝脏, 其他组织含量极少[1]。当肝实质细胞性损害时, 血清GD活性呈不同程度的升高, 对肝损害的早期诊断及预后判断有较高的特异性[2], 但因测定方法不适用于生化自动分析仪而不能常规应用于临床。为此, 我们建立了以鸟嘌呤为基质的GD速率测定法, 使其能适用于自动生化分析仪。同时对GD测定在肝病中的诊断价值做了进一步探讨。

材料和方法
一、实验对象

对照组为辽宁医学院体检健康学生, 男50名, 女50名, 年龄为2025周岁。患者组为辽宁医学院附属第三医院住院患者139例, 男75例, 女64例, 年龄为2075岁。其中急性黄疸型肝炎40例、慢性活动性肝炎40例、继发性肝癌14例、肝癌10例、肝硬化20例、梗阻性黄疸15例。所有对象均空腹抽静脉血2 mL, 立即送检。

二、试剂与仪器

1. 200 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH值7.0) NaH2PO4· H2O 16.59 g、Na2HPO4· 2H2O 10.76 g加蒸馏水至1 000 mL溶解, 调pH值为7.0。

2. 50 mmol/L鸟嘌呤底物贮存液 750 mg鸟嘌呤溶于0.5 mmol/L NaOH 14.0 mL中, 加蒸馏水至100 mL。

3. 20 mmol/L 2.4二氯酚溶液 2, 4-二氯酚326.0 mg溶于蒸馏水中, 并加至100 mL。

4. 50 mmol/L 4-氨基安替比林(4-AAP) 4-AAP 1.016 g溶于100 mL磷酸盐缓冲液中。

5. 反应液1(R1) 4-AAP 40 mL, 加黄嘌呤氧化酶(XOD, Sigma公司, 酶活性16 770 U/L)1.2 mL, 再加过氧化物酶(POD, 上海生化所, 酶活性250 000 U/L)4 mL, 加磷酸盐缓冲液至200 mL。

6. 反应液2(R2) 取鸟嘌呤底物贮存液0.356 mL, 加2, 4-二氯酚13.9 mL, 加磷酸盐缓冲液至100 mL(每日新鲜配制)。

7. 仪器 日立7170A全自动生化分析仪。

三、方法

1. 原理 鸟嘌呤+H2O黄嘌呤+NH3; 黄嘌呤+H2O+O2尿酸+H2O2; 2H2O2+2, 4-二氯酚+4-AAP醌亚胺红色化合物。该醌亚胺红色化合物在510 nm波长下有最大吸收峰, 其吸光度的变化与GD活性成正比。

2. 酶单位定义 每升血清(血浆)在37 ℃ 1 min内生成1 mmol的黄嘌呤所需的GD量为一个酶活性单位, 即国际单位U/L。

3. 测定参数 反应类型:Rate A; 主/次波长:510/630 nm; 温度:37 ℃; 样本量:20 μ L; R1量:250 μ L; 孵育时间:2 min; R2量:50 μ L; 总反应时间:10 min。仪器自动记录34个吸光度点, 计算出GD的反应速率。

结 果
一、缓冲液pH值的选择

用pH值6.0、6.4、6.8、7.0、7.2、7.4、7.8、8.0的磷酸盐缓冲液在25 ℃下分别配制工作试剂, 其他条件不变, 测定患者混合血清, 活性最高者为最适pH。本法最适pH值为7.0。

二、鸟嘌呤底物浓度的选择

用200 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH值7.0)配制一系列浓度不同的底物溶液, 对一混合血清进行GD酶活性测定, 观察底物对酶促反应速度的影响, 按Lineweawer-Burk法进行作图, 求得鸟嘌呤的米氏常数(Km)=1.09× 10-2 mmol/L, 底物浓度选为0.16 mmol/L, 该底物浓度可达最大反应速度的94%。

三、线性试验

取一混合血清(32 U/L)依次稀释成为3.2、6.4、12.8、19.2、25.6、32.0 U/L进行测定, 结果显示在13.50 U/L以下呈线性关系。

四、重复试验

取高、中、低混合血清各1份, GD活性分别为9、6、3 U/L。连续测定10次, 同时作批间测定10 d, 结果见表1。本法批内、批间变异系数(CV)较小, 精密度良好。

表1 精密度试验结果
五、参考值范围

应用本法测定100名健康学生(男50名, 女50名)血清GD活性。结果呈偏态分布。健康人检不出或酶活性很弱, 故用百分位数法计算第95百分位数(P95)单侧参考范围。P95< 1.08 U/L。

六、各种肝病患者GD活性的变化

对已确诊的各种肝病进行GD活性测定, 结果见表2。

表2 各种肝病患者GD测定结果( x-± s)
讨 论

通过对GD测定方法的改进, 使其适用于全自动生化分析仪, 从而使GD作为常规生化肝功能项目成为可能。XOD在试剂中最终浓度以10 U/L为最佳, 当POD≥ 190 U/L时可达最大反应速度, 本研究选用500 U/L; 反应时间从90 s至10 min速度呈线性[3]; 该方法重复性良好(批内CV为2.53%, 批间CV为3.57%)

本研究用的测定参数是基于日立7170生化分析仪建立的, 如果使用其他生化分析仪, 可利用公式来设计参数:

GD(U/L)= △A/min×106×TV33100×L×SV× 2

式中33 100为2, 4-二氯酚摩尔消光系数; TV为总反应体积; SV为样本体积; L为比色杯光径; × 2为每2分子过氧化氢生成1分子色素。

本研究表明, 血清GD测定对肝实质细胞性损害特别是急性损伤有较高的特异性。从表1可看出急性黄疸型肝炎、继发性肝癌患者GD活性明显升高, 其敏感性和特异性都优于肝功能其他酶类项目, 如丙氨酸氨基转移酶(ALT)等[1, 3]。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Canepari S, Castellano P, Cernia E, et al. Determination of guanase activity in normal and pathological sera by high-performance liquid chromatography[J]. Biomed Chromatogr, 1995, 9(3): 130-134. [本文引用:2] [JCR: 1.945]
[2] Nishikawa Y, Fukumoto K. Kinetic measurement of gu-anine deaminase in serum with a centrifugal analyzer[J]. Clin Chem, 1981, 27(4): 560-561. [本文引用:1] [JCR: 7.149]
[3] 王坤, 施前. 实用诊断酶学[M]. 第2版. 上海: 上海医科大学出版社, 2000: 444-445. [本文引用:2]