引用本文
俞娟, 王惠民, 杨曙梅, 孙长江, 丛辉, 陈连英, 王跃国, 朱静仪. 2型糖尿病患者载脂蛋白CⅢ基因多态性与高三酰甘油血症关系研究. 25(8): 601-605
YU Juan, WANG Huimin, YANG Shumei, SUN Changjiang, CONG Hui, CHEN Lianying, WANG Yueguo, ZHU Jingyi. Research on the relationship of apolipoprotein CⅢ gene polymorphisms with hypertriglyceridemia in patients with type 2 diabetes mellitus. Labratory Medicine, 25(8): 601-605  
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2型糖尿病患者载脂蛋白CⅢ基因多态性与高三酰甘油血症关系研究
俞娟1, 王惠民1, 杨曙梅1, 孙长江1, 丛辉1, 陈连英1, 王跃国1, 朱静仪2
1.南通大学附属医院检验医学中心,江苏 南通 226001
2. 南通大学附属医院内分泌科,江苏 南通 226001

通讯作者：王惠民, 联系电话：0513-85052102。

作者简介：俞娟,女,1974年生,硕士,主管技师,主要研究方向为免疫学及分子生物学。

基金:江苏省医学重点学科建设资助项目（XK200723）; 南通大学自然科学项目(08Z057)
摘要
目的

探讨中国南通地区汉族2型糖尿病 (T2DM) 患者中高三酰甘油血症(HTG)是否与载脂蛋白CⅢ(apo CⅢ)基因启动子区T-455C和C-482T多态性有关。

方法

采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性检测212例T2DM患者apo CⅢ-455和-482位点多态性的基因型和等位基因频率,同时检测相关生化指标。

结果

apo CⅢ T-455C和C-482T多态性位点之间存在强连锁不平衡( D'>0.7, r2 > 0. 6, P<0.000 1)。等位基因以常见等位基因-455T和-482C为主,-455和-482位点基因型均分别以杂合型-455TC和-482CT为主。此2个多态性位点等位基因和基因型频率在正常三酰甘油(NTG)组和HTG组之间差异均无统计学意义( P>0.05)。-455CC和-455TC型患HTG的风险与野生型-455TT相比差异无统计学意义( P>0.05),比值比( OR)[95%可信区间( CI)]分别为0.79(0.31~1.99)和1.09(0.52~2.28)。-482TT和-482CT型患HTG的风险与-482CC相比差异也无统计学意义( P>0.05), OR (95% CI)分别为1.33(0.53~3.34)和1.65(0.78~3.51)。所有相关生化指标在这2个多态性位点各基因型之间差异也均无统计学意义( P>0.05)。

结论

在中国南通地区汉族T2DM患者中,未发现apo CⅢ基因启动子区多态性与HTG有关联,与非T2DM人群中研究结果不一致。

关键词: 载脂蛋白CⅢ; 高三酰甘油血症; 糖尿病; 2型; 多态性; 胰岛素反应元件
中图分类号:Q513 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)08-0601-05
Research on the relationship of apolipoprotein CⅢ gene polymorphisms with hypertriglyceridemia in patients with type 2 diabetes mellitus
YU Juan1, WANG Huimin1, YANG Shumei1, SUN Changjiang1, CONG Hui1, CHEN Lianying1, WANG Yueguo1, ZHU Jingyi2
1. Laboratory Medicine Center, Affiliated Hospital of Nantong University, Jiangsu Nantong 226001, China
2. Department of Endocrinology, Affiliated Hospital of Nantong University, Jiangsu Nantong 226001, China
Abstract
Objective

To investigate the relationship of promoter, T-455C and C-428T, polymorphisms in apolipoprotein CⅢ(apo CⅢ) gene and hypertriglyceridemia (HTG) in patients with type 2 diabetes mellitus(T2DM) among Chinese Han population in Nantong.

Methods

Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP) was performed to detect the genotype and allele frequencies of T-455C and C-482T polymorphisms in apo CⅢ promoters, and the levels of serum lipid and related profiles were also determined in 212 patients with T2DM.

Results

The apo CⅢ T-455C and C-482T polymorphisms were in strong linkage disequilibrium (D'>0.7, r2 > 0.6, P<0.000 1). -455T and -482C were the common alleles, and heterozygous -455TC and -482CT were the major genotypes in the study. There was no significant difference in distribution of genotype and allele frequencies of T-455C and C-482T polymorphisms between the normal triglyceride (NTG) group and HTG group ( P>0.05). Compared with wild type -455TT, the HTG risks of -455CC and -455TC had no statistically significant difference with the odds ratio ( OR) [95% confidence interval ( CI)] [0.79(0.31-1.99)] and [1.09(0.52-2.28)] respectively( P>0.05). Compared with wild type -482CC, the HTG risks of -482TT and -482CT had no statistical difference with OR (95% CI) [1.33(0.53-3.34)] and [1.65(0.78-3.51)] respectively ( P>0.05). There was no significant difference in the related levels of biochemical parameters ( P>0.05).

Conclusions

Promoter polymorphisms of apo CⅢ gene are not associated with HTG in patients with T2DM between the genotypes of the two polymorphisms in Chinese Han population in Nantong. The result is inconsistent with someone without T2DM.

Keyword: Apolipoprotein C#cod#x02162;; Hypertriglyceridemia; Diabetes mellitus; type 2; Polymorphism; Insulin response element

高三酰甘油血症(hypertriglyceridemia, HTG)是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)常见脂质紊乱型, 也是T2DM发生大血管病变如冠心病(coronary heart disease, CHD)的独立危险因素[1]。而三酰甘油(triglyceride, TG)与载脂蛋白CⅢ (apolipoprotein CⅢ , apo CⅢ )关系非常密切[2], 后者是由79个氨基酸残基组成的糖蛋白, 其主要作用为抑制脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase, LPL)活性, 从而抑制TG水解, 在T2DM的发生发展中发挥重要作用[3]。

近年来apo CIII基因启动子区的多态性与HTG的关系备受研究者关注, 因为有研究揭示启动子区胰岛素反应元件(insulin response element, IRE)内-455或-482位单碱基改变即可以消除胰岛素在转录水平对apo CIII的负调节作用, 从而引起HTG。以往研究曾对非T2DM人群进行研究, 结论支持IRE多态性促进HTG发生, 与野生基因型-455TT或-482CC相比, 变异基因型-455CC或-482TT患HTG的风险性明显增高, 并且具有较高的TG和apo CⅢ 水平[4, 5]。与相关文献报道一致[6, 7]。

由于T2DM患者常伴有HTG, 且存在严重胰岛素抵抗, 而apo CIII基因启动子区单碱基改变导致胰岛素不能再下调apo CIII转录作用, 进而产生HTG。那么T2DM患者的HTG究竟由谁引起, 其与多态性之间是否有关联。我们对中国南通地区汉族人群212例T2DM患者的apo CIII基因启动子区多态性和对象人群的生化指标进行研究, 以期探讨这2个多态性与T2DM合并HTG的关系, 进一步了解T2DM与脂质紊乱的关系。

材料和方法
一、对象

212例T2DM均为2008年6月至2009年12月南通大学附属医院内分泌科住院患者, 男112例, 女90例, 年龄21~86岁, 符合1999年世界卫生组织(WHO)的T2DM诊断标准。将T2DM患者按照TG水平分为2组, 132例正常TG(NTG)组诊断标准为TG< 1.7 mmol/L, 其中男73例、女59例, 年龄28~80岁; 80例HTG组诊断标准为TG > 1.9 mmol/L, 其中男46例、女34例, 年龄21~82岁。以上2组均排除肝、肾、甲状腺等疾病, 均系南通地区、无血缘关系的汉族人群。

二、方法

1. 基因多态性检测 从1 mL EDTA抗凝外周血中提取有核细胞, 用蛋白酶K和白细胞裂解液隔夜消化, 然后用酚/氯仿/异戊醇法抽提基因组DNA, 溶于适量TE缓冲液, -20 ℃保存备用。核酸扩增程序如下:每个扩增体系为50 μ L, 其中包括基因组DNA 100 ng、10× 聚合酶链反应(PCR)缓冲液5 μ L, 200 μ mol/L dNTPs、2.0 mmol/L MgCl2、0.1 μ mol/L上下游引物(primer 5软件设计, p1 5'-GCACTCGCCTGCCTGGATT-3', p2 5'-TGAGTCCACG CTGCTGTCCC-3'), 1.5 U Taq DNA 聚合酶。扩增条件:95 ℃预变性3 min, 94 ℃ 30 s、60 ℃ 40 s、72 ℃ 30 s, 共33个循环, 最后72 ℃延伸5 min。-455位点产物分析用琼脂糖凝胶电泳方法[4]:PCR产物用BseGⅠ 内切酶(立陶宛Fermentas公司)于55 ℃消化2 h, 3.0 %琼脂糖凝胶电泳, 凝胶自动成像系统进行成像分析。-482位点产物分析用微流控芯片电泳方法[5]:PCR产物用MspⅠ 内切酶(立陶宛Fermentas公司)于37 ℃消化3 h, 进行微流控芯片电泳(美国安捷伦公司)。

2. 生化指标检测 空腹12 h, 采取外周静脉血3 mL, 分离血清保存于-80 ℃, 用于相关生化指标分析。氧化酶法测定总胆固醇(TC)、TG(英国RANDOX公司)和空腹血糖(FBG)(温州东瓯生物), 化学修饰酶法测定高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)(上海玉兰生物), 免疫透射比浊法测定apo A-Ⅰ 、apo B(上海申峰生物)、apo CⅢ (日本第一化学株式会社), 以上测定均在日立7600-020型全自动生化分析仪(日本日立公司)上进行。化学发光法测定胰岛素(INS)和C肽(CPT)(北京源德生物), 液相色谱法测定糖化血红蛋白(HBA1c)( 美国Bio-Rad公司)。

三、统计学处理

apo CⅢ 基因频率及基因型频率采用基因计数法计算。采用Arlequin群体遗传学分析软件计算各配对位点间的连锁不平衡参数, 并检验其是否呈连锁不平衡, 程度用D'表示。采用χ 2检验进行Hardy-Weinberg平衡吻合度检验, 基因型和等位基因的组间比较采用χ 2检验, 并以比值比(odds ratio, OR)和95%可信区间(confidence interval, CI)表示相对风险度。NTG组与HTG组间正态分布的生化指标用 x-± s表示, 统计方法采用t检验; 偏态分布的指标采用中位数(范围)表示, 统计方法采用Kruskal-wallis Test分析。基因组间数据比较使用单因素方差分析(one-way ANOVA)检验。以上数据统计由stata 8.0统计软件完成。P< 0.05表示差异有统计学意义。

结 果
一、基因型判别

见文献[4, 5]。

二、T2DM患者中apo CⅢ -455和-482位点等位基因和基因型频率分布

NTG组和HTG组人群中T-455C和C-482T多态性基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡, 具有群体代表性(P> 0.05)。2组中-455和-482位点基因型均分别以杂合型-455TC和-482CT为主, 等位基因分别以常见等位基因-455T和-482C为主, 在NTG组和HTG组之间等位基因和基因型频率差异均无统计学意义(P> 0.05)。见表1、表2。

表1 T2DM患者中NTG及HTG的apo CⅢ -455位点基因型和等位基因频率
表2 T2DM患者中NTG及HTG的apo CⅢ -482位点基因型和等位基因频率
三、连锁不平衡分析

连锁不平衡检验系数|D'|> 0.7(P< 0.000 1)或相关系数(r2)> 1/3, 均可认为配对两位点具有强连锁不平衡。apo CⅢ -455和-482位点之间存在强连锁不平衡(D'> 0.7, r2> 0.6, P< 0.000 1)。见表3。

表3 T2DM中apo CⅢ T-455C/C-482T位点基因多态间的连锁不平衡分析
四、apo CIII基因启动子区多态性T-455C和C-482T基因型与HTG的相关性分析

-455CC和-455TC型患HTG的风险与-455TT相比, OR值分别为0.79(95%CI: 0.31~1.99)和1.09(95%CI: 0.52~2.28), 差异无统计学意义(P> 0.05); -482TT和-482CT型患HTG的风险与-482CC相比, OR值分别为1.33 (95%CI:0.53~3.34)和1.65 (95%CI:0.78~3.51), 差异也无统计学意义(P> 0.05)。见表3。

表3 apo CIII基因启动子区多态性T-455C和C-482T基因型与HTG风险性的关系
五、apo CIII不同基因型间相关生化指标的比较

血脂和糖尿病相关指标, 如TC、TG、HDL-C、LDL-C、apo A-Ⅰ 、apo B、apo A-Ⅰ /apo B比值、apo CⅢ 、FBG、CPT、HBA1c等在apo CIII T-455C 3种基因型之间均无统计学差异, 同样结论显现在C-482T各基因型之间。见表4。

表4 apo CIII不同基因型间相关生化指标比较
讨 论

T2DM发病率呈逐年上升趋势, 其并发症如脂质代谢紊乱、CHD等严重影响人们健康和生活质量。TG升高是CHD和T2DM的独立危险因子[1], 但以TG升高为主要特征的脂代谢紊乱原因尚未完全明了, 目前认为是由于胰岛素抵抗、环境因素、遗传缺陷等多方面因素导致T2DM患者体内富TG脂蛋白代谢障碍所致, 其中基因因素是发病的内因[8]。

Ito 等研究发现, 在转基因小鼠中, apo CⅢ 过量表达, 能引起严重HTG; Maeda等在基因敲除小鼠中发现, 不引起餐后HTG; Li 等在细胞培养研究中发现, 胰岛素下调apo CⅢ 基因表达, 从而使TG稳定在一定水平。目前大多学者认为, apo CⅢ 启动子区IRE内基因突变体丢失了胰岛素下调apo CⅢ 表达功能, 结果导致apo CⅢ 过表达并促进HTG发展, 引发CHD等相关并发症; 而低水平的血浆apo CⅢ 浓度引发CHD的风险性明显降低[9]。但在对其IRE内这2个多态性位点与HTG的相关性研究中发现, 不同人种间得出的结论不尽相同。而研究对象的选择标准是否一致, 是否包含胰岛素抵抗因素如T2DM, 是值得考虑的。

为分析apo CⅢ 启动子区T-455C和C-482T位点间的关系, 采用连锁不平衡关联分析。对连锁不平衡的度量目前常用的是D'和r2。D'和r2值为零时, 连锁完全平衡; D'和r2值为l时, 连锁完全不平衡。本研究将两位点进行连锁不平衡分析, 结果显示两位点间D'均> 0.7, r2均> 0.6, 呈强连锁不平衡(见表2), 提示2个多态性位点之间存在相互作用。

有学者曾对apo CⅢ 基因启动子区多态性与HTG的相关性进行研究, 并得出相关性结论[4, 5], 但这是在排除了T2DM患者的前提下得出的结论。T2DM患者中T-455C和C-482T多态性在NTG组和HTG组之间等位基因和基因型频率差异均无统计学意义(P> 0.05)(见表1), 而在非T2DM人群中, 这2个多态性在NTG组和HTG组之间等位基因和基因型频率差异有统计学意义[4, 5]。同样, 在T2DM人群中, 与野生纯合子-455TT或-482CC相比, 变异纯合子-455CC或-482TT患HTG的风险差异无统计学意义(P> 0.05)(见表3); 而在非T2DM人群中, 患HTG的风险显著增加, 差异有统计学意义(P< 0.05)[4, 5]。在对本研究apo CⅢ 这2个多态性各自的3种不同基因型间相关生化指标的比较中发现, 在T2DM患者中, 血脂和糖尿病相关指标(包括TC、TG、HDL-C、LDL-C、apo A-Ⅰ 、apo B、apo A-Ⅰ /apo B比值、apo CⅢ 、FBG、CPT、HBA1c等)在apo CIII T-455C 3种基因型之间差异均无统计学意义, 同样结论显现在C-482T各基因型之间(见表4); 而在非T2DM人群中, 变异纯合子-455CC较野生纯合子-455TT具有较高水平的apo CⅢ 、TG和TC, 变异纯合子-482TT较野生纯合子-482CC具有较高水平的apo CⅢ 、TG和较低水平的apo A-Ⅰ /apo B比值(P< 0.05) [4, 5]。因此, 本研究结果显示, 虽然apo CⅢ 基因启动子区的多态性在非T2DM人群中与HTG的发生呈正相关, 而在T2DM患者中这种关系不存在。

本研究结果提示, 在T2DM患者中, apo CⅢ 基因启动子区的T-455C和C-482T这2个多态性位点的野生纯合子-455TT或-482CC对胰岛素下调apo CⅢ 表达的作用消失, 将可能导致apo CⅢ 表达过量, LPL活性受抑制, TRL清除延迟, TG正常水解减少, 最终导致HTG, 进而引起脂质代谢紊乱, 引发一系列并发症。因此推测apo CⅢ 基因启动子区的多态性对apo CⅢ 表达的调节效应受个体对胰岛素敏感度的影响。如果胰岛素是通过IRE来调节apo CⅢ 表达的, 那么在对胰岛素敏感的人群中, IRE野生型-455TT或-482CC会对胰岛素高度敏感从而下调apo CⅢ 表达, 并进一步减少CHD等心血管并发症的发生率。然而, 对于存在胰岛素抵抗的人群如T2DM患者, 由于调节apo CⅢ 表达的上游信号转导通路受阻, IRE与胰岛素不能再有效发生特异性相互作用, 导致胰岛素的下调作用消失, 结果增强了apo CⅢ 介导的抑制LPL活性的效应, 产生HTG和异常的血糖代谢[10]。这也在一定程度上解释了为什么T2DM患者较易产生脂质代谢紊乱和并发心血管疾病。

综上所述, 本研究结果显示, 在T2DM患者中, 不管apo CⅢ 基因启动子区T-455C或C-482T是否发生变异, apo CⅢ 都会被过量表达 [10], 与非T2DM人群中研究结果不一致。本研究结果有助于进一步深入了解T2DM脂质代谢与apo CⅢ 基因之间的关系, 并注意在选择研究对象作相关研究时, 需充分考虑T2DM患者胰岛素敏感度的影响。

致谢:感谢南通大学公共卫生学院肖静、何书在统计方面给予的指导。

The authors have declared that no competing interests exist.

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