引用本文
郭书忍, 郑芳, 杨娜, 刘泽金. 湖北汉族人群TRIB1基因多态性分布特征及其与冠心病的关联性分析. 25(7): 560-564
GUO Shuren, ZHENG Fang, YANG Na, LIU Zejin. Distribution characteristics of TRIB1 gene polymorphism and association of TRIB1 gene polymorphism with coronary heart disease in Han population of Hubei province. Labratory Medicine, 25(7): 560-564  
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《检验医学》编辑部
湖北汉族人群TRIB1基因多态性分布特征及其与冠心病的关联性分析
郭书忍1, 郑芳1, 杨娜1, 刘泽金2
1. 武汉大学中南医院基因诊断中心,湖北 武汉 430071
2. 武汉亚洲心脏病医院检验科,湖北 武汉 430071

通讯作者：郑 芳,联系电话：027-67813233。

作者简介：郭书忍,女,1982年生,硕士,主要从事动脉粥样硬化性疾病的易感基因鉴定。

基金:中央高校基本科研业务费专项资金资助项目（20103030101000066）
摘要
目的

研究tribbles 同源物1(果蝇)(TRIB1)基因内含子区和3'UTR区2个标签单核甘酸多态性(Tag SNP)(内含子区:rs235110;3' UTR区:rs235108)与冠心病的关系及其在湖北省汉族人群中的分布特征。

方法

采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法对湖北地区236名健康汉族人和139例冠心病患者的TRIB1基因单核苷酸多态性(SNP)进行分析。并用PCR产物纯化后测序验证酶切结果。同时检测研究对象的血浆三酰甘油(TG)和总胆固醇(TC)水平。

结果

TRIB1基因的2个TagSNPs的分布特征符合Hardy-Weinberg平衡定律(rs2235110: χ2=0.481, P=0.488;rs2235108: χ2=0.570, P=0.450)。TG水平在冠心病组rs2235110位点基因型亚组内,差异有统计学意义( P<0.05)。上述多态性位点在冠心病患者和正常人群中的分布无差异。rs2235110具有中等多态信息量(PIC)(rs2235110位点PIC=0.368 7,H=0.487 5),几乎达到其PIC的理论最大值。

结论

本研究人群的rs235108、rs235110各位点的基因型和等位基因频率可代表湖北省汉族人群的分布特征,与HapMap数据库中其他SNP构成单倍型联用可作为一个理想的遗传标记。但没有发现其与冠心病的相关性。

关键词: TRIB1基因; 标签单核甘酸多态性; 冠心病
中图分类号:Q754 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)07-0560-05
Distribution characteristics of TRIB1 gene polymorphism and association of TRIB1 gene polymorphism with coronary heart disease in Han population of Hubei province
GUO Shuren1, ZHENG Fang1, YANG Na1, LIU Zejin2
1. Center for Gene Diagnosis, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Hubei Wuhan 430071, China
2. Department of Clinical Laboratory, Wuhan Asian Heart Hospital, Hubei Wuhan 430071, China
Abstract
Objective

To investigate the relationship of coronary heart disease (CHD) and two tag single nucleotide polymorphisms (Tag SNP) [intro region: rs235110; 3' untranslated region (3' UTR):rs235108] in tribbles congener 1 (drosophila) (TRIB1) gene and the distributions of TRIB1 gene in Han population of Hubei province.

Methods

By polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) method, TRIB1 gene single nucleotide polymorphisms (SNP) in 236 healthy subjects and 139 patients with CHD were analyzed, and further verified by sequencing after purifying the PCR products. The levels of plasma triglyceride (TG) and total cholesterol (TC) were detected.

Results

The distributions of two Tag SNPs were in Hardy-Weinberg balance(rs2235110: χ2=0.481, P=0.488;rs2235108: χ2=0.570, P=0.450). There was significant difference for TG in the subtypes of rs2235110 in CHD group ( P<0.05). There was no significant difference in the alleles and genotype distributions of two Tag SNPs between controls and patients. There was moderate polymorphism information content (PIC) in rs2235110 (PIC=0.368 7,H=0.487 5), almost to the maximum theory value of PIC.

Conclusions

The distributions of the genotypes and alleles for each Tag SNP in this study represent the variants of the TRIB 1 gene in Han population of Hubei province. Those two Tag SNPs combined with other Tag SNPs in HapMap can be used as an ideal genetic marker. However, the relation of Tag SNPs and CHD is not found.

Keyword: TRIB1 gene; Tag single nucleotide polymorphism; Coronary heart disease

果蝇tribbles蛋白通过调节纺锤丝的活性, 调控细胞的有丝分裂, 在果蝇腹裂沟形成过程中发挥着重要的调节作用[1]。Dower等[2]通过转录表达方法, 筛选介导炎症反应的细胞因子时, 在Hela细胞中发现了调节白细胞介素-8(IL-8)启动子活性的人类tribbles 同源物1(果蝇)(htrb1)。哺乳动物中tribbles家族有3种:htrb1、htrb2、htrb3。其中htrb1广泛表达于人类的各种组织中, 以骨骼肌、甲状腺、胰腺、外周血白细胞及骨髓中表达最高[3]。人类的tribbles家族有着与果蝇不同的作用, htrb1即TRIB1基因的表达产物是血管平滑肌细胞的增生和趋化的一个有力的调节因子[4], 而血管平滑肌细胞的增生和趋化是动脉粥样硬化形成的主要病理过程, 动脉粥样硬化极易发展为冠心病。同时全基因组扫描研究证实邻近TRIB1基因的一个单核甘酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNP)rs17321515与血浆中三酰甘油(TG)水平密切相关[5]。但是迄今仍没有中国人群汉族人群中关于TRIB1基因变异与冠心病相关性的研究。因此我们选取TRIB1基因的标签单核甘酸多态性(Tag SNP)位点, 在湖北省汉族人群中进行TRIB1基因多态性的分布特征及其与冠心病的关联性分析。

材料和方法
一、对象

139例冠心病患者为2008年6月至2009年3月份在武汉市亚洲心脏病医院就诊的患者。所有冠心病患者均经过冠状动脉造影确诊, 冠状动脉造影显示在供应心脏血液的主要血管中, 至少有一支血管有≥ 50%的具有临床意义的狭窄。236名正常对照者为武汉大学中南医院健康体检人员。患者和对照者的种族及地区来源无明显差异, 均为汉族, 无血缘关系, 入选者均无严重肝、肾、肺功能不全, 无严重贫血、营养不良、代谢综合征、风湿病、 恶性肿瘤及生殖系统、 内分泌系统疾病, 自身免疫性疾病和感染性疾病史。所有研究对象均经知情同意。

二、方法

1. 基因组DNA提取和血脂水平的检测 所有研究对象均空腹12 h后于次日清晨采集2 mL静脉血, 经乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝, 分离白细胞, 用改良NaI法提取基因组DNA。同时采集4 mL静脉血, 经肝素抗凝, 分离血浆用全自动生化分析仪检测血脂水平。

2. Tag SNP的选取 从hapmap数据库中选取 TRIB1基因的Tag SNP, 选取标准为:连锁不平衡系数> 0.8; 最小等位基因频率> 0.1, 人群为CHB。

3. 聚合酶链反应(PCR)扩增目的基因片段 采用专门的引物设计软件设计特异性引物, PCR扩增TRIB1基因包含选定的Tag SNP位点的片段, 所用引物由武汉赛百盛公司合成。引物序列和扩增片段的长度见表1。PCR反应总体积为25 μ L包括10× 缓冲液2.5 μ L, 2.5 mmol/L Mg2+1.5 μ L, 2.0 mmol/L dNTP 2.5 μ L, 10 pmol/μ L上游、下游引物各1.0 μ L, 100 ng DNA模板, 1 U Taq聚合酶。以上 PCR反应条件为95 ℃预变性5 min, 95 ℃变性45 s, 相应的退火温度退火45 s, 72 ℃延伸45 s, 35个循环, 72 ℃延伸10 min。

表1 TRIB1基因Tag SNP引物

4. PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)分析及基因分型 TRIB1基因rs2235108位点T→ C置换, rs2235110位点A→ G置换。2个SNP位点存在或经碱基突变后均存在限制性酶切位点, PCR产物以相应的限制性内切酶进行酶切, rs2235108位点由NlaIII(CATG^)酶识别, rs2235110位点由BstXI(CCAN5^NTGG)酶识别, 内切酶均为NEB公司产品。酶切后产物用8%聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶电泳, 在室温环境下200 V电泳5 min后改为150 V恒压电泳1 h, 硝酸银染色, 并扫描染色结果。酶切结果均经测序验证。rs2235108和rs2235110位点PCR-RFLP分析电泳结果见图1, 测序结果见图2、图3。

'>图1 rs2235108和rs2235110位点PCR-RFLP电泳图

图2 rs2235110位点AG型测序图

图3 rs2235108位点TC型测序图

三、统计学方法

所有资料均采用SPSS14.0软件进行统计分析, 各组等位基因频率采用基因计数法, 检验基因型频率与Hardy-Weinberg平衡定律符合程度、组间基因型与等位基因频率比较均采用χ 2检验。rs2235110各基因型间血脂水平的比较采用ANOVA方差分析, rs2235108位点将CT型与TT型合并后, 各基因型间血脂水平的比较采用t检验。SNP位点的多态信息量(PIC)和杂合度(H)按公式PIC=1- ∑i=2npi2- ∑i=2n-2 ∑j=1+2n2 pi2pj2(Pi、Pj分别为群体中第i、j个等位基因频率, n为等位基因数)及H=1-Σ pi2(pi为群体中等位基因的频率)计算。

结 果
一、湖北汉族健康人群TRIB1基因Tag SNP的分布特征与Hardy-Weinberg定律吻合度检验

湖北汉族健康人在TRIB1基因rs2235110(76名)和rs2235108(236名)多态性位点的基因型分布结果与经Hardy-Weinberg定律计算的预期基因型频率比较, 差异无统计学意义(rs2235110:χ 2=0.481, P=0.488; rs2235108:χ 2=0.570, P=0.450), 表明具有群体代表性。rs2235110位点PIC=0.368 7, H=0.487 5; 属于中等信息量的SNP标记, 几乎达到其PIC的理论最大值。rs2235108位点PIC=0.128 5, H=0.137 3, 该位点的信息含量较低。

二、rs2235108和rs2235110位点在湖北地区冠心病患者和正常人群基因变异频率比较

湖北地区冠心病和正常人群在上述2个位点上的基因型和等位基因频率分布, 差异无统计学意义(P> 0.05), 见表2、表3。

表2 rs2235108位点冠心病患者与正常对照组间基因型和等位基因频率的比较
表3 rs2235110位点冠心病患者与正常对照组间基因型和等位基因频率的比较
三、rs2235108和rs2235110位点在湖北地区汉族人群和世界不同地区人群基因变异频率比较

2个位点在在湖北地区汉族人群和世界不同地区人群(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=snp)基因变异频率在分布上, 差异有统计学意义(P< 0.05), 见表4和表5。

表4 rs2235108位点不同人群中的基因型及等位基因频率比较
表5 rs2235110位点不同人群中的基因型及等位基因频率比较
四、冠心病组和正常对照组各基因型的血脂水平比较

冠心病组rs2235108位点CC基因型的个体TG水平高于正常对照组(P< 0.05), 总胆固醇(TC)水平低于正常对照组(P< 0.05)。冠心病组TC+TT型的个体TG水平高于正常对照组(P< 0.05), TC水平差异无统计学意义(P> 0.05); 对于rs2235110位点, TG水平在各基因型间差异圴有统计学意义(P< 0.05)。见表6、表7。

表6 冠心病组和正常对照组rs2235108位点各基因型间血脂水平比较( x-± s, mmol/L)
表7 冠心病组和正常对照组rs2235110位点各基因型间血脂水平比较( x-± s, mmol/L)
讨 论

对rs2235110和rs2235108位点基因型频率分析发现2个位点基因型分布符合Hardy-weinberg平衡, 具有群体代表性。种族之间两位点基因型分布具有很强的异质性, 没有发现两位点与冠心病的关联性。统计学分析显示冠心病组与正常对照组相比, TG高而TC低, 冠心病组和对照组内各基因型间血脂水平除了TG在冠心病患者rs2235110位点基因型亚组内有差异外, 其余均无差异。

针对TRIB1基因2个Tag SNP的研究, 没有发现TRIB1基因变异与冠心病的相关性。可能有三方面的原因:全基因组扫描的研究对象是13 000 个冠心病患者, 通过对大样本的研究发现邻近TRIB1基因的SNP rs17321515与血浆TG水平密切相关, 中国汉族人群中rs2235108位点T等位基因频率只有0.072, 对于等位基因频率较低的多态性位点, 研究其与疾病的关联性需要大样本, 本研究只有139例患者和236名正常对照者, 没有达到较高的检验效能所需的样本数。其二, 不同人群中TRIB1基因的变异分布有统计学差异。其三, 这些变异可能对TRIB1的表达水平和功能影响较小, 和疾病没有关联性。

冠心病组与正常对照组相比TG高而TC低, 其可能原因为:冠心病组研究对象为住院经冠脉造影确诊的冠心病患者, 大部分患者在确诊冠心病前已发现血脂升高, 且发生过心血管事件, 已经服用他汀类及其他降脂药。目前的降脂药他汀类药物可明显降低TC和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平[6, 7](能降低TC 22%~42%, 降低LDL-C 23%~55%), 而针对TG的药物疗效不明显, 故冠心病组的TC较正常对照者组低可能是受药物的影响, TG反映的是患者本身的血脂状态。对血脂水平和等位基因频率进行统计分析, 仅在患者组发现rs2235110位点和TG的相关性。rs2235108位点由于等位基因T的频率很低(0.072), 需要大样本才能发现微效等位基因的作用; rs2235110虽然两等位基因的频率高, 但仅在患者组内各基因型亚组间发现TG水平有统计学差异, 总体样本例数太少, 不能排除抽样误差的影响, 仍需进一步扩大样本量验证。

Tribbles 作为过丝裂原介导的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)途径的一个强有力的调节因子, 能促进血管平滑肌细胞的增生和趋化。TRIB1的表达水平在动脉粥样硬化患者中高于一般人群[4], Tribbles在某种程度上促进动脉粥样硬化的进展。后续实验可以增大样本量, 探讨TRIB1基因的Tag SNP位点与冠心病的关系, 或者选择该基因启动子区的变异, 研究基因的变异与TRIB1表达水平的关系, 进一步探讨TRIB1基因多态性与冠心病的关系。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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