引用本文
黄金保, 黄铁生, 王细宏. 半胱氨酸蛋白酶抑制剂C基因G73A位点的多态性与急性心肌梗死关系的探讨. 25(7): 557-559
HUANG Jinbao, HUANG Tiesheng, WANG Xihong. A study of the relationship between the polymorphism of cystatin C gene G73A point and acute myocardial infarction. Labratory Medicine, 25(7): 557-559  
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半胱氨酸蛋白酶抑制剂C基因G73A位点的多态性与急性心肌梗死关系的探讨
黄金保, 黄铁生, 王细宏
池州市人民医院,安徽 池州 247000

作者简介：黄金保,男,1975年生,硕士,技师,主要从事临床生化方面的工作。

摘要
目的

探讨半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cys C) 基因外显子+73G/A(简称G73A)位点变异与急性心肌梗死(AMI)的关系;同时观察池州地区汉族AMI患者血浆Cys C浓度的变化。

方法

采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法分析112例AMI患者和110名健康对照者全血DNA中Cys C基因G73A位点变异的多态性分布情况,同时检测AMI组和对照组血浆Cys C浓度。

结果

AMI患者血浆Cys C浓度明显低于对照组( P<0.05)。在AMI患者组中,G73A位点GG/GA/AA基因型频率分别为64.3%、28.6%和7.1%,G等位基因频率为78.6%;对照组G73A位点GG/GA/AA基因型频率分别为67.3%、28.3%和4.5%,G等位基因频率为81.4%,2组比较差异无统计学意义( P>0.05)。

结论

Cys C水平的降低可能是AMI发病的危险因素之一;池州地区汉族AMI患者和正常人群中存在Cys C基因G73A位点变异的多态性,这个位点发生变异可能对AMI疾病的的发生不起主要作用。

关键词: 半胱氨酸蛋白酶抑制剂C; 基因; 急性心肌梗死; 变异; 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性; 多态现象
中图分类号:R446.1 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)07-0557-03
A study of the relationship between the polymorphism of cystatin C gene G73A point and acute myocardial infarction
HUANG Jinbao, HUANG Tiesheng, WANG Xihong
The People's Hospital of Chizhou,Anhui Chizhou 247000, China
Abstract
Objective

To investigate the correlation between the point mutation of cystatin C (Cys C) gene exon+73G/A(G73A) and acute myocardial infarction (AMI), and observe the plasma levels of Cys C in Chinese Han patients with AMI at Chizou.

Methods

112 patients with AMI and 110 control subjects were enrolled in this study and their polymorphism distribution of Cys C gene G73A point mutation were determined in whole blood DNA by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP)assay. Plasma levels of Cys C were determined in patients with AMI and control subjects.

Results

The concentration of Cys C in the plasma of the patients with AMI was significantly lower than that in control subjects ( P<0.05). To G73A gene point, the genotype frequencies of GG, GA and AA were 64.3%, 28.6% and 7.1% in patients with AMI and 67.3%, 28.3% and 4.5% in control subjects. The G allele frequency was 78.6% in patients with AMI and 81.4% in control subjects. There was no statistical difference in genotype and allele frequency between the patients with AMI and control subjects ( P>0.05).

Conclusions

The decreased Cys C level is a possible dangerous factor to AMI. The point mutation of Cys C gene G73A showes polymorphism distribution in Chinese Han patients with AMI and healthy subjects at Chizhou. The mutation may not play a major role in AMI disease.

Keyword: Cystatin C; Gene; Acute myocardial infarction; Mutation; Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism; Polymorphism

半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cys C)是半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族2中的主要成员之一。在生理条件下, Cys C的重要功能是抑制内源性的半胱氨酸蛋白酶的活性, 是目前发现的对组织蛋白酶B抑制作用最强的抑制物。Cys C不仅能够抑制半胱氨酸蛋白酶的活性, 还能促进细胞增生、参与炎症反应过程。急性心肌梗死(AMI)的发病基础是动脉粥样硬化及血栓的形成。目前, 基础研究方面的进展证明炎性反应在动脉粥样硬化的发生、发展及最终形成过程中有重要作用[1~3]。目前国内对Cys C作为评价肾小球损害的早期指标做了大量研究, 但对Cys C基因方面的研究很少。我们试图从基因水平探讨AMI患者Cys C基因外显子+73G/A(简称G73A)位点的变异情况, 同时观察AMI患者和正常对照人群血浆中Cys C浓度的变化, 对Cys C及其基因位点变异的多态性和AMI的关系作一次探讨性研究。

材料和方法
一、对象

选取2005年10月至2007年10月在池州市人民医院进行住院治疗的池州市汉族AMI患者112例(其中男62例、女50例, 平均年龄52岁, 经病案查阅确系池州籍贯), 所有AMI患者均通过临床指征、心电图、肌钙蛋白、心肌酶谱等指标进行确诊, 并排除肾功能异常患者。选取体检结果均为正常的池州市汉族健康人群110名(其中男58名、女52名, 平均年龄46岁, 均为池州籍贯)作为对照组。

二、仪器与试剂

1. 试剂及引物序列如下 上游引物:5'-GGTCCTCTCTATCTAGCTCC-3', 下游引物: 5'-CTCCTGGAAGCTGATCTTAG-3'; 引物由上海生物工程公司合成; TaqDNA聚合酶购于大连宝生物公司, 三磷酸脱氧核糖核苷(dNTP)、聚合酶链反应扩增体系(PCR-Mix)购于北京天根科技有限公司, 限制性内切酶Cfr 42I又名Sac II, 购于Fermentals公司(立陶宛); 琼脂糖为西班牙原装进口, 十二烷基硫酸钠(SDS)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)碱购自华美生物工程公司, 蛋白酶K购自Sigma公司, 50bp DNA ladder (Takama)购于大连宝生物公司。

2. 仪器 梯度聚合酶链反应(PCR)扩增仪(德国Eppendoff 5330型); 全自动凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司); DYY-Ⅲ 2型稳压稳流电泳仪(北京六一仪器厂); DU640型紫外分光光度计(贝克曼公司); OLYMPUS AU640型全自动生化分析仪等。

三、方法

采集患者和体检个体新鲜抗凝静脉血5 mL, 分离血浆, 吸取500 μ L血浆加入1.5 mL的Epp试管中, 置于-70 ℃保存, 用于检测血浆Cys C的浓度; 剩余部分-20 ℃保存, 用于提取DNA。Cys C浓度的检测采用免疫比浊法, DNA提取方法为酚/氯仿提取法。

四、统计学方法

统计学处理采用SPSS11.5软件, 计量资料间的比较采用t检验, 计数资料间的比较采用χ 2检验, 检验水准α =0.05, P< 0.05表示差异有统计学意义。

结 果
一、Hardy-Weinberg 遗传平衡检验

在AMI组和对照组中, 通过对G73A基因型频数分布的Hardy-Weinberg平衡检验, 表明AMI组与对照组G73A基因型频数的分布均符合Hardy-Weinberg平衡, 可以进行统计学处理, 见表1。

表1 AMI组与对照组G73A基因型分布Hardy-Weinberg平衡检验
二、AMI组和对照组基因频率分布

在AMI组和对照组G73A位点各种基因型频率以及等位基因频率见表2。2组基因型比较差异无统计学意义(χ 2=0.718, P> 0.05), 等位基因比较, 差异也无统计学意义(χ 2=0.540, P> 0.05)。

表2 Cys C基因G73A位点变异的各种基因型频率及等位基因频率
三、PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)检测结果

PCR扩增产物B4~B13的电泳图谱见图1。

图1 G73A位点PCR扩增产物电泳图谱

四、G73A基因位点酶切产物结果

G73A基因位点扩增产物经内切酶酶切后, 可能出现3种情况:出现135和423 bp条带的为野生型纯合子GG基因型, 出现135、423和558 bp 条带的为杂合子GA基因型, 出现558 bp 条带的为突变型纯合子AA基因型。由此判断, 图2中B4、B5、B6、B7、B9、B12样本为野生型纯合子GG基因型; B8、B10、B11样本为杂合子GA基因型; B13样本为突变型纯合子AA基因型。

图2 G73A基因位点扩增产物酶切后凝胶电泳图

五、AMI组和对照组血浆Cys C浓度分析

AMI组血浆Cys C浓度为(0.90± 0.11)mg/L, 对照组血浆Cys C浓度为(1.07± 0.15)mg/L, 2组比较, 差异有统计学意义(P< 0.05); 对照组不同基因型之间血浆Cys C浓度比较, 差异均无统计学意义(P> 0.05)。见表3。

表3 对照组Cys C基因G73A位点不同基因型血浆Cys C浓度比较
讨 论

目前, 国内很多有关Cys C的文献报道[4, 5]中, Cys C被建议作为评价肾小球滤过率的最有效指标, 特别在诊断早期肾功能损害上具有重要的临床应用价值。另外, Cys C与心血管疾病的发生也有一定的关系[6]。遗传性脑出血伴淀粉样变是直接与Cys C 基因突变有关的临床疾病, 可造成脑血管破裂、脑出血等严重后果。Crawford等[7]报道高加索人群中Cys C基因外显子G73A变异与老年性痴呆的迟发性发病相关, 基因变异后发生老年性痴呆的危险性增加; Noto等[8]的报道中提到Cys C基因外显子G73A发生变异影响血浆中Cys C的浓度。

本研究结果表明池州地区汉族人群中存在Cys C基因G73A位点变异的多态性, 但基因型频率和等位基因频率在AMI组和对照组之间差异均无统计学意义, 可以推测Cys C基因G73A位点发生变异情况与AMI发病无关联。Cys C基因位点发生变异可能会影响血浆Cys C的浓度及其活性的变化。本研究结果表明, AMI组血浆Cys C浓度明显低于对照组, 但结合Cys C基因G73A位点变异的多态性分析, 可以推测AMI患者血浆Cys C浓度的降低可能不是基因发生突变引起, 这2个位点发生变异可能对AMI的发病不起主要作用。至于Cys C对于AMI诊断的敏感性程度以及是否可以作为预防AMI发生的生化指标, 尚需要作进一步的研究。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Shi GP, Sukhova GK, Grubb A, et al. Cystatin C defi-ciency in human atherosclerosis and aortic aneurysms[J]. J Clin Invest, 1999, 104(9): 1191-1197. [本文引用:1] [JCR: 12.812]
[2] Sukhova GK, Wang B, Libby P, et al. Cystatin C defi-ciency increases elastic lamina degradation and aortic dilatation in apolipoprotein E-null mice[J]. Circ Res, 2005, 96(3): 368-375. [本文引用:1] [JCR: 11.861]
[3] Eriksson P, Deguchi H, Samnegård A, et al. Human evidence that the cystatin C gene is implicated in focal progression of coronary artery disease[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2004, 4(3): 551-557. [本文引用:1]
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[7] Crawford FC, Freeman MJ, Schinka JA, et al. A poly-morphism in the cystatin C gene is a novel risk factor for late-onset Alzheimer's disease[J]. Neurology, 2000, 55(6): 763-768. [本文引用:1] [JCR: 8.249]
[8] Noto D, Cefalu AB, Barbagallo CM, et al. Cystatin C levels are decreased in acute myocardial infarction: effect of cystatin C G73A gene polymorphism on plasma levels[J]. Int J Cardiol, 2005, 101(2): 213-217. [本文引用:1] [JCR: 5.509]