改良选择性培养基在侵袭性真菌感染诊断中的探讨
华丽1, 戎霞君2, 孙佳彬1, 萧晨露3, 倪语星3, 季育华1
1. 上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科,上海 200025
2. 上海交通大学医学院附属瑞金医院呼吸科,上海 200025
3. 上海交通大学医学院附属瑞金医院微生物科,上海 200025

通讯作者:季育华,联系电话:021-64370045-600637。

作者简介:华丽,女,1979年生,学士,医师,主要从事临床微生物学研究。

摘要
目的

通过改良培养基的营养和抑制能力,提高常规送检痰标本中真菌的检出率,为临床早期监测、诊断提供依据。

方法

通过观察白假丝酵母菌和烟曲霉标准菌株开始生长的时间、菌株开始产孢的时间及产孢时菌落直径,平行比较改良选择性培养基(Medium B)与实验室常规培养基[马铃薯培养基(PDA)、沙保弱培养基(SDA)、科马嘉显色培养基(CHROMagar)]对真菌检出能力的差异,并比较添加抗菌药物的Medium B(Medium B+)和CHROMagar平板抗污染菌的能力。实施临床血液恶性肿瘤和造血干细胞移植(HSCT)患者痰标本的随机跟踪分析。

结果

不同种类培养基真菌菌落开始生长、产孢以及接种后同一时间菌落直径即真菌分离能力由高至低依次为Medium B> PDA> SDA> CHROMagar;Medium B+能有效抑制痰标本中常见的致病菌,有利于痰标本中真菌的分离;随机跟踪的待检标本,有1例只在Medium B+中被检出。

结论

若选择一种选择性培养基用于血液恶性肿瘤和HSCT患者痰标本真菌的常规检测,Medium B+较佳;为了提高真菌检出率和准确性,推荐同时应用Medium B+和CHROMagar。

关键词: 改良选择性培养基; 侵袭性真菌感染; 血液恶性肿瘤; 造血干细胞移植
中图分类号:R446.5 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)07-0519-05
Investigation of a modified selective medium in the diagnosis of invasive fungal infection
HUA Li1, RONG Xiajun2, SUN Jiabin1, XIAO Chenlu3, NI Yuxing3, JI Yuhua1
1. Department of Clinical Laboratory,Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200025, China
2. Department of Pneumology,Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200025, China
3. Department of Microbiology,Ruijin Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200025,China
Abstract
Objective

To improve the isolation rate of fungi in the routine submission sputum samples by modified nutrition and suppression capabilities of medium, and provide the reference for early detection and diagnosis.

Methods

Through observing the initial time of strain growth, the initial time of sporulation and the colony diameter when sporulation in Candida albicans and Aspergillus fumigatus, the isolation abilities of modified selective medium (Medium B) and routine medium [potato dextrose agar(PDA), Sabouraud dextrose agar(SDA) and CHROMagar medium] were compared. The anti-contaminating abilities with double-antibody Medium B (Medium B+) and CHROMagar were compared. The clinical sputum samples from patients with hematological malignancy and hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) were traced and analyzed randomly.

Results

The fungus isolation ability results of different types of culture medium (the initial time of strain growth and sporulation and the colony diameter measured at the same time) were Medium B> PDA> SDA> CHROMagar. The Medium B+ had an ability to suppress common pathogenic bacteria and to improve the isolation of fungi in sputum samples. Moreover, there was only one case detected in Medium B+ among tracing samples.

Conclusions

When employing one selective medium for the routine detection of fungi in the sputum samples from the patients with hematological malignancy and HSCT,Medium B+ is better. It should use the combined employment of Medium B+ and CHROMagar, in order to improve the isolation rate and accuracy of fungus detection.

Keyword: Modified selective medium; Invasive fungal infection; Hematological malignancy; Hematopoietic stem cell transplantation

近年来, 由于造血干细胞移植(HSCT)技术的日臻成熟、广谱抗菌药物的大量使用、各种新型免疫抑制剂和化疗药物的临床应用, 侵袭性真菌感染(invasive fungal infection, IFI) 已成为血液恶性肿瘤和接受HSCT患者的严重并发症之一。在各种IFI诊断方法中, 实验室痰标本的真菌培养是IFI诊断的基石, 但由于其敏感性低、耗时长而难以满足临床的需要。有文献报道, 痰标本中因为大量的细菌, 主要是革兰阴性菌的存在以及培养基营养、培养条件等诸原因可影响真菌的检出率[1, 2]。为此, 本实验室在文献[3]推荐的改良选择性培养基(Medium B)的基础上作部分改良, 对改良后培养基的真菌检出率及临床应用进行了探讨。

材料和方法
一、材料

1. 菌株来源 白假丝酵母菌(ATCC 90028)和烟曲霉(ATCC 10894)由上海市华山医院真菌室馈赠, 9株非耐药细菌包括3株铜绿假单胞菌、3株肺炎克雷伯菌、1株嗜麦芽窄食单胞菌、1株鲍曼不动杆菌、1株金黄色葡萄球菌来自恶性肿瘤和接受HSCT IFI临床诊断患者的痰标本。

2. 培养基 (1)Medium B:葡萄糖16.7 g/L、琼脂20 g/L、酵母浸膏(OXOID L21, 北京拜尔迪公司)30 g/L、蛋白胨(OXOID L42, 北京拜尔迪公司)6.8 g/L, 溶于1 000 mL蒸馏水中, 调整pH值至6.3, 高压灭菌15 min, 制成平板; (2)马铃薯培养基(PDA):东北产(市售)马铃薯200 g, 洗净去皮切片, 加水180 mL, 煮沸30 min后过滤, 再加葡萄糖20 g, 将过滤液补足至1 000 mL, 调整pH值至5.55.7, 115 ℃高压灭菌15 min后制成平板; (3)沙保弱培养基(SDA):葡萄糖40 g、蛋白胨10 g、琼脂13 g, 制成1 L溶液; (4)科玛嘉显色培养基(CHROMagar):购自上海科马嘉微生物技术有限公司。

3. 仪器和试剂 法国生物梅里埃ATB expression 自动细菌鉴定/ 药敏系统; 30和37 ℃孵育箱; ATB ID 32C鉴定卡为法国生物梅里埃公司产品; 游标卡尺(HD1539, STAINLESS)购自广东电子产品有限公司; 青霉素、链霉素(BS732, 10 mL)购自上海华舜生物工程公司。

4. 标本来源 2009年11月至2010年3月期间上海市瑞金医院血液科病区、九舍九病区、血液临床中心、骨髓移植病区痰标本19份。

二、方法

1. 培养基的制备 Medium B、PDA、 SDA、 CHROMagar的制备见上述描述, Medium B+为Medium B高压冷却至55 ℃, 1∶ 100加入抗菌药物(终浓度为100 U/mL)后, 混匀倾注平板制成。

2. 接种菌悬液的制备 将白假丝酵母菌(ATCC 90028)和烟曲霉(ATCC 10894)标准株分别接种SDA 30 ℃和PDA 37 ℃孵育复苏24 h, 然后转种新鲜SDA和PDA平板分别于24和72 h收获, 即无菌条件下, 用灭菌0.85%生理盐水冲洗、刮取, 并洗涤2~3次后调整浓度(白假丝酵母菌为0.5麦氏浓度; 烟曲霉为5× 106个孢子/mL), 同样程序制备临床分离细菌, 其浓度调制为0.5麦氏浓度。接种时取各种菌悬液和孢子悬液20 μ L。

3. 不同培养基分离能力比较 用上述制备的白假丝酵母菌悬液和烟曲霉孢子悬液分别接种4种不同的培养基, 每块接种菌量20 μ L, 同一种培养基接种3块, 并根据需要分别置30和37 ℃有氧孵育, 逐日观察记录, 包括2种菌开始生长时间, 烟曲霉开始产孢时间以及产孢时菌落直径等, 以菌落开始出现时间、产孢时间越早以及同时测得菌落直径越大说明培养基分离效果越好。

4. 观察添加抗菌药物后Medium B+抑菌效果和对真菌分离率的影响 用0.5麦氏浓度各临床分离株20 μ L接种于Medium B+、CHROMagar以及Medium B, 同时也接种伴有定量真菌的模拟混合菌液(分别含白假丝酵母菌0.5麦氏浓度, 烟曲霉5× 106个孢子/mL)。30或37 ℃培养孵育24~48 h后, 观察培养基上细菌和真菌的生长情况判断抑菌效果, 重复性以每次接种3块相同平板为基准。

5. 临床待检标本的随机跟踪 将制备的Medium B+和市售CHROMagar平板平行接种上海市瑞金医院临床血液科病区、九舍九病区、血液临床中心、骨髓移植病区高度怀疑真菌感染患者的痰标本, 要求6 h内完成接种, 37 ℃有氧孵育, 7 d不生长判为阴性, 有细菌和酵母菌生长者经ATB expression鉴定, 遇丝状菌生长时则请上海市华山医院真菌室作鉴定(包括可能的分子生物学方法), 送检标本同时做显微镜直接镜检。

结 果
一、不同培养基真菌分离能力的比较

我们将预先制备的具一定浓度的真菌菌悬液等量接种到本研究选择的4种培养基, 经观察记录发现Medium B上白假丝酵母菌落和烟曲霉开始出现时间、烟曲霉产孢时间均早于其他3种培养基, 且接种后于相同时间测得菌落直径最大, 见图1、2。4种不同培养基分离能力由高至低分别为Medium B> PDA> SDA> CHROMagar。

图1 白假丝酵母菌(ATCC 90028)接种第36 h时4种培养基菌落直径大小

图2 烟曲霉(ATCC 10894)接种第36 h时4种培养基菌落直径大小及产孢情况

二、抑制痰标本中常见细菌对真菌分离率的影响

当将痰标本中常见细菌, 主要是革兰阴性菌(0.5麦氏单位, 20 μ L/平板)接种Medium B+、CHROMagar和Medium B, 24 h后观察发现Medium B+无细菌生长(结果未显示), 而白假丝酵母菌和烟曲霉的生长不受影响。见图3、4。表1的结果显示临床分离株在Medium B+能被有效抑制。

图3 白假丝酵母菌(ATCC 90028)在Medium B+与Medium B菌落大小和数量

图4 烟曲霉(ATCC 10894)在Medium B+与Medium B菌落大小和数量

表1 临床分离细菌株在Medium B+、CHROMagar和Medium B的生长情况
三、临床标本的跟踪结果

共跟踪19例患者的19份痰标本, 结果有1例只在Medium B+平板上生长, 经ATB ID 32C系统鉴定为光滑假丝酵母菌, 具体培养分离结果见表2

表2 19份痰标本在不同培养基上的分离结果
讨 论

IFI是血液恶性肿瘤化疗或HSCT后的严重并发症之一, 其高发病率和致死率已经引起人们极大的关注。若能早期发现、早期治疗将给IFI患者带来重获新生的福音。我们曾在评价血清抗原血症检测对IFI早期诊断价值的研究中发现, 目前常规的临床真菌分离率相当低, 尤其曲霉[4]。Leventakos等[5]坚持近10年的追踪, 从57例血液恶性肿瘤患者因IFI死亡的尸解分析中发现, 曲霉菌属占58%, 酵母菌属占26%, 与Chandrasekar等[6]最近的报道一致, 认为该类免疫低下人群, IFI的主要病原体为曲霉菌属。

IFI的实验室诊断方法主要包括培养法和非培养法, 后者主要包括真菌抗原血症和DNA血症检测, 其中抗原血症检测尚缺乏特异性、阳性阈值以及其在中国人群中实际应用指导等方面的评价, 而DNA血症检测由于缺乏规范性等原因尚未被广泛应用。Nagano等[3]的研究报道对我们的启示很大, 传统且经典的真菌培养是评价非培养法诊断IFI的“ 金标准” 。而真菌培养敏感性低下, 其原因除真菌自身的特性外, 还包括标本中是否含有其他病原体, 文献[4, 5]指出痰标本中可含108~109 cfu/mL细菌, 主要为革兰阴性菌, 还包括少量革兰阳性菌, 他们的存在是影响痰标本中真菌检出率的重要原因之一。为此, 本实验室致力于培养基的改良以提高真菌培养检出率的研究。我们首先应用白假丝酵母菌和烟曲霉的菌悬液评估4种不同培养基对真菌的检出率, 结果显示白假丝酵母菌和烟曲霉在4种培养基上的生长检出率排序为Medium B> PDA> SDA> CHROMagar。随后进行临床痰标本的随机跟踪, 结果提示选择添加一定浓度抗菌药物的Medium B进行真菌检测, 能够有效的抑制一定量的细菌, 而对同时伴随接种的白假丝酵母菌和烟曲霉无影响, 当同时应用Medium B+和CHROMagar, 可以提高真菌分离率和诊断准确率。由于本次实验跟踪的临床病例数不多, 尚缺乏准确的实验室数据, 我们将继续进行临床患者标本的跟踪, 对Medium B+在不同来源标本中的应用价值进行评价。

目前提供的实验结果表明, 要提高临床IFI的检出率, 需要在充分认识被分离真菌特性的基础上, 对培养基的营养、抗菌药物的选择、培养条件进行不断改良、优化, 配合其他IFI诊断手段, 一定能实现临床IFI早期诊断和早期治疗。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Toscano CM, Bell M, Zukerman C, et al. Gram-negative bloodstream infections in hematopoietic stem cell transplant patients: the roles of needleless device use, bathing practices, and catheter care[J]. Am J Infect Control, 2009 , 37(4): 327-334. [本文引用:1] [JCR: 2.731]
[2] Maschmeyer G, Beinert T, Buchheidt D, et al. Diagnosis and antimicrobial therapy of lung infiltrates in febrile neutropenic patients: guidelines of the infectious diseases working party of the German Society of Haematology and Oncology[J]. Eur J Cancer, 2009, 45(14): 2462-2472. [本文引用:1] [JCR: 5.061]
[3] Nagano Y, Millar BC, Goldsmith CE, et al. Development of selective media for the isolation of yeasts and filamentous fungi from the sputum of adult patients with cystic fibrosis (CF)[J]. J Cyst Fibros, 2008, 7(6): 566-572. [本文引用:1] [JCR: 2.873]
[4] 华丽, 萧晨露, 唐暐, . 血清1, 3-β-D葡聚糖和半乳甘露聚糖检测对造血干细胞移值受者侵袭性真菌感染的诊断意义[J]. 诊断学理论与实践, 2010, 9(1): 31-34. [本文引用:1]
[5] Leventakos K, Lewis RE, Kontoyiannis DP, et al. Fungal infections in leukemia patients: how do we prevent and treat them[J]. Clin Infect Dis, 2010, 50(3): 405-415. [本文引用:1] [JCR: 9.374]
[6] Chand rasekar PH, Ramesh M. Challenges in the mana-gement of invasive aspergillosis in hematopoietic stem cell transplantation[J]. Expert Rev Anti Infect Ther, 2009, 7(10): 1151-1153. [本文引用:1]