引用本文
章强强, 赵颖, 李莉, 朱均昊. 利用BIOFOSUN系统鉴定常见曲霉. 25(7): 515-518
ZHANG Qiangqiang, ZHAO Ying, LI Li, ZHU Junhao. Identification of common Aspergillus using BIOFOSUN system . Labratory Medicine, 25(7): 515-518  
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利用BIOFOSUN系统鉴定常见曲霉
章强强, 赵颖, 李莉, 朱均昊
复旦大学附属华山医院皮肤科真菌室,上海 200040

作者简介：章强强,男,1956年生,学士,主任技师,主要从事真菌及真菌病的研究。

摘要
目的

评估BIOFOSUN系统鉴定临床常见曲霉的可靠性。

方法

采用常规形态学方法及分子生物学方法测定菌株rDNA保守区基因序列鉴定77株临床收集的曲霉,并与BIOFOSUN系统鉴定结果比较。

结果

BIOFOSUN系统对构巢曲霉、杂色曲霉、寄生曲霉、棒曲霉、泡盛曲霉、焦曲霉、黄柄曲霉及日本曲霉种的鉴定符合率均为100%,对黄曲霉、烟曲霉、黑曲霉、土曲霉的鉴定符合率分别为92%、85%、75%及70%,对于土曲霉的鉴定符合率相对较差,利用BIOFOSUN系统提供的形态学图谱,观察其具有特征性的菌落外型及色素,可以帮助鉴定。使用BIOFOSUN系统可以将一些形态学特征接近,且又不能通过rDNA基因测序方法进行区分的曲霉作出鉴定。

结论

BIOFOSUN系统可以利用计算机进行数据分析,自动化和标准化程度高,大大简化鉴定程序,为曲霉的标准化鉴定提供了一个有效的方法。

关键词: BIOFOSUN系统; 真菌鉴定; 曲霉; 分子生物学鉴定; 表型鉴定
中图分类号:R446.5 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)07-0515-04
Identification of common Aspergillus using BIOFOSUN system
ZHANG Qiangqiang, ZHAO Ying, LI Li, ZHU Junhao
Fungus Room, Department of Dermatology, Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China
Abstract
Objective

To evaluate the reliability of BIOFOSUN system in identifying common Aspergillus.

Methods

77 clinical isolates of Aspergillus were identified by routine morphological and molecular biological sequencing of rDNA conservative areas. The results of identification were compared with those from BIOFOSUN system.

Results

The coincidence rates of BIOFOSUN system identifying Aspergillus nidulans, Aspergillus fumigatus, Aspergillus parasiticus, Aspergillus clavatus, Aspergillus awamori, Aspergillus ustus, Aspergillus flavipes and Aspergillus japonicus were all 100%. The coincidence rates of identifying Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger and Aspergillus terreus were 92%, 85%, 75% and 70% respectively. The coincidence rate of identifying Aspergillus terreus was relatively low, but the shape and pigment of the colony from BIOFOSUN system morphological images were characteristic, which could help identification. BIOFOSUN system could differentiate the strains with similar morphological feature, which could not be differentiated by rDNA sequencing.

Conclusions

BIOFOSUN system can analyze data through computer, which is highly automatic and standard. This system can simplify the procedure of identification consumedly and provide an effective method for standardized identification of Aspergillus.

Keyword: BIOFOSUN system; Fungal identification; Aspergillus; Molecular biological identification; Phenotypic identification

曲霉感染越来越威胁着危重患者的健康与生命, 已成为仅次于酵母菌病的真菌感染性疾病[1], 我国曲霉病病死率高达50%~100%[2]。 随着抗真菌药物的不断涌现及广泛应用, 不同种的真菌对不同药物的敏感性也有差别, 耐药问题日益显现。因此, 对病原真菌鉴定到种的水平具有临床治疗和流行病学研究的双重意义, 解决这一问题的关键在于提高实验室的真菌鉴定水平。现今曲霉的鉴定是临床微生物实验室的难点, 传统的形态学方法鉴定存在着鉴定时间较长, 鉴定准确率不高, 相当程度上依赖于鉴定人员的经验的缺点, 而分子生物学的方法存在着操作繁琐、成本高、时间长的不足。因此, 需要一个标准的系统化、商品化的产品对临床上的致病真菌作鉴定。BIOFOSUN真菌鉴定板适用于鉴定临床常见致病及条件致病性真菌, 使用方便, 标准客观, 性能稳定, 目前可以鉴定618种不同的丝状真菌和酵母样真菌。此系统利用真菌对不同碳源的利用或氧化能力, 提供一个通过95种生化反应来鉴定真菌的标准化方法。通过使用BIOFOSUN系统的配套软件, 分析真菌在鉴定板上的代谢模式并与数据库进行比对来鉴定真菌。

材料和方法
一、 材料

1. 菌株 实验室保藏的曲霉共77株, 其中烟曲霉13株, 黄曲霉13株, 黑曲霉8株, 泡盛曲霉2株, 土曲霉10株, 聚多曲霉3株, 亮白曲霉2株, 焦曲霉3株, 构巢曲霉8株, 杂色曲霉6株, 黄柄曲霉2株, 日本曲霉1株, 寄生曲霉3株及棒曲霉3株, 含ATCC标准菌株 4株:黄曲霉(ATCC 28539)、黑曲霉(ATCC 16888)、烟曲霉(ATCC 10894)和土曲霉(ATCC 10020)。

2. 培养基 麦芽浸汁琼脂平板:麦芽浸汁粉20 g, 琼脂 18 g, 蒸馏水1 000 mL; 马铃薯葡萄糖琼脂:马铃薯200 g, 葡萄糖20 g, 琼脂 20 g, 蒸馏水1 000 mL; 察氏琼脂:NaNO3 3 g, K2HPO4 1 g, KCl 0.5 g, MgSO4· 7H2O 0.5 g, FeSO4 0.01 g, 蔗糖20 g, 琼脂20 g, 蒸馏水1 000 mL。

3. 试剂与仪器 BIOFOSUN真菌鉴定板(BIOFOSUN公司); 12头移液器(BU20055, BIOHIT公司); 浊度计(ZDY-II, 上海复星佰珞生物技术公司); 75% T 菌液浊度标准管(Biolog公司); BIOFOSUN微孔板读数仪(BIOFOSUN公司); BIOFOSUN微生物鉴定药敏分析软件ML400; BIOFOSUN真菌鉴定板条接种液(0.25%结陵胶, 0.03%吐温40)。

二、 方法

1. 常规形态学鉴定 将待鉴菌种接种于察氏琼脂, 26 ℃培养714 d后观察形态学特征, 根据其菌落形态、颜色及镜下结构(顶囊、分生孢子头、分生孢子梗及分生孢子的形态), 按照曲霉属群的检索表作出鉴定。

2. 分子生物学鉴定 通过菌株rDNA保守区基因序列测定鉴定菌种。使用rDNA测序的方法对所测试的77株真菌进行种类鉴定, 并以GenBank上给出的种类鉴定结果为准。具体的过程如下:(1)使用物理化学方法相结合破碎真菌的细胞壁, 使用氯仿-异戊醇对DNA进行粗提, 而后使用醋酸铵除去多余的蛋白质, 最后使用异丙醇沉淀DNA; (2)使用真菌通用的ITS引物扩增真菌rDNA的ITS1-5.8S-ITS2片段, 使用葡萄糖凝胶电泳确认扩增效果, 扩增片段为600 dp左右; (3)将扩增成功的片段送上海生工生物工程有限公司测序, 并采用正反链同时测序方法; (4)将测序结果登陆www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ 进行结果查询。

3. 使用BIOFOSUN系统鉴定曲霉 (1)将待检曲霉接种麦芽浸出液培养基, 26 ℃培养57 d; (2)用空白接种液在浊度计上调整浊度为100%, 采集曲霉孢子以BIOFOSUN真菌鉴定板条接种液调成浊度为75%± 3%; (3)将配置好的菌悬液加入BIOFOSUN真菌鉴定微孔板中, 每孔100 μ L。使用石蜡膜将板条密封后, 26 ℃培养。在24、48、72和96 h使用微孔板读数仪和分析软件读取结果; (4)将菌落形态和镜下结构同软件中的图片数据库进行比较。

4. 相关曲霉鉴别试验 (1)硝酸盐同化试验:将黑曲霉群真菌接种于坂口· 王氏培养基(NaNO2 1.5 g, KH2PO4 1 g, KCl 0.5 g, MgSO4· 7H2O 0.5 g, FeSO4· 7H2O 0.01 g, 蔗糖30 g, 琼脂 20 g, 蒸馏水 100 mL), 培养57 d后观察利用情况。能同化硝酸盐者为黑曲霉, 不能同化黑曲霉的为泡盛曲霉[3]; (2)茴香酮利用试验:将黄曲霉群真菌接种含0.05%茴香酮的察氏培养基, 培养5~7 d观察孢子颜色, 粉红色者为米曲霉[4]。

结 果
一、根据常规形态学的表型鉴定, 并经分子生物学测序结果证实的77株曲霉作BIOFOSUN系统鉴定, 结果见表1。
表1 77株真菌的鉴定符合率
二、在77株曲霉中含13株标准菌株, BIOFOSUN系统鉴定结果见表2, 13株标准菌株的鉴定结果均符合。
表2 BIOFOSUN系统鉴定标准菌株的结果
讨 论

真菌鉴定是临床诊断中重要的基础工作。目前, 对于真菌的鉴定以形态学鉴定为主, 但该方法鉴定所需的时间长, 受人员因素影响大, 对操作人员的经验要求高, 并且对于一些形态上难以区分的真菌, 更是临床鉴定工作的难点; 生理生化实验可以辅助真菌的鉴定, 但费时、费力, 并且结果不稳定。常规的表型鉴定方法相对落后, 导致很多患者得不到正确和及时的诊断而丧失了治疗机会。分子生物学鉴定方法, 如DNA序列分析、聚合酶链反应、限制性片段长度多态性分析以及单链构象多态性分析等[5~7], 虽然近些年来有所发展, 但其测试成本高, 需要的设备多, 目前尚无比较成熟的商品化系统能够全面完成检测工作, 不能普遍应用于临床工作中。抗原抗体检测方法利用抗原抗体反应检测真菌产生的特定抗原[89], 易出现假阳性或假阴性, 最大的问题就是对于获得性免疫缺陷综合征(AIDS)患者真菌感染复发的检验, 因为AIDS患者不能消除抗原, 所以即使在非活跃感染的时候, 抗原的检测也为阳性。商品化的真菌鉴定试剂盒, 如科玛嘉酵母菌显色培养基、法国Biomerieux公司的API 20C和美国REMEL公司的RAPD真菌鉴定系统等虽可鉴定多种酵母[10], 但对于丝状真菌, 如曲霉、青霉、镰刀霉、孢子丝菌等则不能进行鉴定。

曲霉感染是引起深部真菌感染的主要菌种, 有文献报道, 超过95%的土曲霉对于两性霉素B都是耐药的[11~13] , 因此将曲霉鉴定到种对于抗真菌药物的选择以及侵袭性曲霉菌感染的治疗均有重要的意义。迄今曲霉主要依靠菌落在察氏琼脂等相关培养基上的外形、色素及镜下结构作出鉴定, 要求有相当经验的鉴定人员, 通常所鉴定的只是一些常见的菌种, 如烟曲霉、黄曲霉及黑曲霉等。所以, 采用标准的试剂盒鉴定是发展的方向。BIOFOSUN微生物鉴定分析系统是目前市场上惟一可以鉴定丝状真菌的标准化系统。其使用一种新的表型测试的方法, 即代谢指纹鉴定技术, 利用微生物对不同碳源进行新陈代谢的碳源利用率差异对微生物进行鉴定, 其中包括了针对微生物的种类筛选95种不同碳源, 配合不同的氧化还原反应显色剂, 固定于96孔板上。当接种菌悬液后培养一定时间, 通过仪器测定吸光度和浊度, 得到该菌的代谢模式图谱, 经同数据库中标准代谢模式图的对比, 对待测真菌进行鉴定。目前, 该系统已经用于食品、药品及化妆品行业的致病微生物鉴定, 工业应用微生物研究, 质量控制及产品研发等[1417]。本研究用BIOFOSUN系统对临床菌株的鉴定结果进行了分析与评估。

目前, 曲霉可以分为18个群、180余种, 而在临床上最为常见的主要有8个种。本研究结果发现, BIOFOSUN系统对构巢曲霉、杂色曲霉、寄生曲霉、棒曲霉、泡盛曲霉、焦曲霉、黄柄曲霉及日本曲霉种的鉴定准确率分别为100%, 对黄曲霉、烟曲霉、黑曲霉、土曲霉分别为92%、85%、75%及70%, 对土曲霉的鉴定准确率相对较差, 认为可能是测试菌株数量太少的缘故, 但根据BIOFOSUN系统提供的土曲霉菌落形态和显微镜下形态的图谱, 其菌落的外型及色素等特征可帮助临床实验室对菌株进行准确鉴定。 对于亮白曲霉和聚多曲霉测试的符合率分别为50%和67%, 因为该2种曲霉测试菌株例数较少, 需要后续的测试分析。

使用BIOFOSUN系统还可以将一些形态学特征接近, 且不能使用rDNA基因测序的方法进行区分的曲霉作分类鉴定, 如黑曲霉和泡盛曲霉, 黄曲霉和米曲霉, 这2组曲霉利用形态学和ITS序列分析的方法均不能准确鉴定, 而BIOFOSUN系统均可进行准确鉴定。如研究中共测试的10株经形态学及分子生物学鉴定为黑曲霉群的曲霉, BIOFOSUN系统又将其分为2种, 即有8株为黑曲霉, 有2株为泡盛曲霉。事实上, 使用rDNA基因测序的方法也无法区分黑曲霉和泡盛曲霉, 因为他们在GenBank中的ITS序列的最大相似度为100%, 若使用硝酸盐同化试验则能准确鉴定。通过硝酸盐同化试验发现上述10株曲霉中有8株均能同化硝酸盐, 为黑曲霉, 而2株不能同化硝酸盐, 为泡盛曲霉, 与BIOFOSUN系统的结果一致。另外, 通过对10株ITS和形态学鉴定为黄曲霉的菌株进行了茴香酮利用试验, 证实这10株曲霉均为黄曲霉, 与 BIOFOSUN系统的鉴定结果一致。

已知BIOFOSUN微生物鉴定分析系统采用的代谢指纹鉴定技术也属表型鉴定, 但与传统的生化反应有质的区别, 后者通过酸碱指示剂检测微生物代谢产物中的pH值改变, 分析微生物对某种营养物质的利用情况。因酸碱比色反应不稳定, 易受外部影响而发生可逆反应, 况且受到指示剂pH值变色范围的限制, 酸碱比色反应方法可检测的营养物质非常有限。前者是利用呼吸链的原理, 检测的是微生物利用营养物质发生的电子传递过程, 微生物利用营养物质发生呼吸作用形成一系列的氧化还原反应, 其中产生还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH), 已知NADH能够使四唑紫(2, 3, 5- triphenyl tetrazolium chloride, TTC)指示剂由无色的氧化型转变为紫色的还原型。利用此原理可检测的营养物质达95种之多, 结果稳定, 不可逆。紫色为阳性, 无色为阴性。

BIOFOSUN微生物鉴定分析系统为曲霉的标准化鉴定提供了一个有效的方法, 对于皮肤癣菌及马拉色菌鉴定的数据库正在建立中, 初步数据已提示上述2类菌利用不同碳源的情况具一定的规律性。总之, BIOFOSUN微生物鉴定分析系统可以利用计算机进行数据分析, 自动化和标准化程度高, 大大简化鉴定程序, 具有数据库大、鉴定范围广等优点[18], 并能获得大量原始数据, 可以广泛应用于临床实验室的菌种鉴定工作及真菌碳源利用方式的研究[19], 尤其是为丝状真菌鉴定提供了良好的技术平台, 有助于推动临床真菌鉴定工作的开展。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] 张宝才. 肺真菌病[J]. 中国呼吸与危重监护杂志, 2003, 2(5): 319-320. [本文引用:1]
[2] 钟南山, 叶枫. 深部真菌感染: 新的挑战与展望[J]. 中华结核和呼吸杂志, 2006, 29(5): 289-290. [本文引用:1]
[3] 中国科学院微生物研究所. 常见与常用真菌[M]. 北京: 科学出版社, 1978: 268. [本文引用:1]
[4] 齐祖同. 中国真菌志-曲霉属及其相关有性型[M]. 北京: 科学出版社, 1997: 99-101. [本文引用:1]
[5] Jordanides NE, Allan EK, McLintock LA, et al. A prospective study of real-time panfungal PCR for the early diagnosis of invasive fungal infection in haemato-oncology patients[J]. Bone Marrow Transplant, 2005, 35(4): 389-395. [本文引用:1] [JCR: 3.541]
[6] Mirhendi H, Makimura K, Zomorodian K, et al. A simple PCR-RFLP method for identification and differentiation of 11 Malassezia species[J]. J Microbiol Methods, 2005, 61(2): 281-284. [本文引用:1] [JCR: 2.161]
[7] Hortal S, Pera J, Galipienso L, et al. Molecular iden-tification of the edible ectomycorrhizal fungus Lactarius deliciosus in the symbiotic and extraradical mycelium stages[J]. J Biotechnol, 2006, 126(2): 123-134. [本文引用:1] [JCR: 3.183]
[8] Anaissie EJ. Diagnosis and therapy of fungal infection in patients with leukemia-new drugs and immunotherapy[J]. Best Pract Res Clin Haematol, 2008, 21(4): 683-690. [本文引用:1]
[9] Pisa D, Ramos M, Garcia P, et al. Fungal infection in patients with serpiginous choroiditis or acute zonal occult outer retinopathy[J]. J Clin Microbiol, 2008, 46(1): 130-135. [本文引用:1] [JCR: 4.068]
[10] Cundell AM. Microbial identification strategies in the pharmaceutical industry[J]. PDA J Pharm Sci Technol, 2006, 60(2): 111-123. [本文引用:1]
[11] Denning D. Invasive aspergillosis[J]. Clin Infect Dis, 1998, 26(4): 781-803. [本文引用:1] [JCR: 9.374]
[12] Oakley KL, Moore CB, Denning DW. In vitro activity of SCH-56592 and comparison with activities of amphotericin B and itraconazole against Aspergillus spp[J]. Antimicrob Agents Chemother, 1997, 41(5): 1124-1126. [本文引用:1]
[13] Iwen PM, Rupp ME, Langnas AN, et al. Invasive pul-monary aspergillosis due to Aspergillus terreus: 12-year experience and review of the literature[J]. Clin Infect Dis, 1998, 26(5): 1092-1097. [本文引用:1] [JCR: 9.374]
[14] Druzhinina IS, Schmoll M, Seiboth B, et al. Global carbon utilization profiles of wild-type, mutant, and transformant strains of Hypocrea jecorina[J]. Appl Environ Microbiol, 2006, 72(3): 2126-2133. [本文引用:1]
[15] Chun SC, Schneider RW, Chung IM. Determination of carbon source utilization of Bacillus and Pythium species by biolog® microplate assay[J]. J Microbiol, 2003, 41(3): 252-258. [本文引用:1] [JCR: 1.276]
[16] Adrianne VR, Rand olph SC. Profiles from Biolog FF plates and morphological characteristics support the recognition of Oidiodendron fimicola sp. Nov[J]. Stud Mycol, 2005, 53(1): 75-82. [本文引用:1] [JCR: 6.231]
[17] Seidl V, Druzhinina IS, Kubicek CP. A screening system for carbon sources enhancing beta-N-acetylgluco-saminidase formation in Hypocrea atroviridis (Trichoderma atroviride)[J]. Microbiology, 2006, 152(Pt7): 2003-2012. [本文引用:1] [JCR: 0.649]
[18] 王丽敏, 李军, 胡小松. 苹果原料中酵母菌的分离鉴定[J]. 中国农业大学学报, 2004, 9(4): 14-17. [本文引用:1]
[19] Gamo M, Shoji T. A method of profiling microbial communities based on a most - probable - number assay that uses BIOLOG plates and multiple sole carbon sources[J]. Appl Environ Microbiol, 1999, 65(10): 4419-4424. [本文引用:1]