引用本文
赵虎, 王寅, 涂婉, 方毅, 庞立峰. 临床常见产AmpC β-内酰胺酶菌株中染色质ampC共同序列的研究. 25(6): 456-460
ZHAO Hu, WANG Yin, TU Wan, FANG Yi, PANG Lifeng. Exploration of the consensus sequence among the genomic ampC from the clinical isolates producing AmpC beta-lactamase. Labratory Medicine, 25(6): 456-460  
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《检验医学》编辑部
临床常见产AmpC β-内酰胺酶菌株中染色质ampC共同序列的研究
赵虎1, 王寅2, 涂婉1, 方毅1, 庞立峰1
1. 复旦大学附属华东医院检验科,上海 200040
2. 浙江省新华医院检验科,浙江 杭州 310005

作者简介：赵虎,男,1962年生,博士,教授,主要从事临床微生物学研究。

基金:上海市科委重点科研基金资助项目（054119509）
摘要
目的

分析临床常见AmpC β-内酰胺酶(简称AmpC酶)产酶菌株中染色质ampC的基因序列,从而为AmpC酶的分子生物学检测以及其调控机制研究提供理论依据。

方法

57株临床常见AmpC酶产酶菌株分离自医院感染患者样本,抽提细菌染色质DNA,聚合酶链反应(PCR)扩增ampC基因并连接入pMD19-T载体,双链测序后比对同种细菌之间和不同种细菌之间染色质ampC基因的同源性和共同序列。根据共同序列设计引物,进一步利用该引物检测染色质ampC。

结果

57株细菌的基因组中,使用PCR扩增出染色质ampC基因41株,并成功测定了其ampC基因的序列。比对后发现大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌和产气肠杆菌的染色质ampC菌种内有很高的同源性,但细菌之间的同源性较低。根据共同序列设计出菌种特异性PCR引物,能够有效的鉴定出染色质ampC基因。

结论

大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌和产气肠杆菌各自染色质ampC具有高度同源性,其菌种特异性的ampC引物可用来检测其染色质ampC的存在。

关键词: AmpC β-内酰胺酶; 染色质ampC; 共同序列
中图分类号:R446.5 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)06-0456-05
Exploration of the consensus sequence among the genomic ampC from the clinical isolates producing AmpC beta-lactamase
ZHAO Hu1, WANG Yin2, TU Wan1, FANG Yi1, PANG Lifeng1
1.Department of Clinical Laboratory, Huadong Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China
2. Department of Clinical Laboratory, Zhejiang Xinhua Hospital, Zhejiang Hangzhou 310005, China
Abstract
Objective

To analyze the consensus sequence among the genomic ampC from the clinical isolates producing AmpC beta-lactamase and provide the theoretical basis for new molecular biological way to determine AmpC beta-lactamase and the regulatory mechanism of AmpC beta-lactamase.

Methods

57 AmpC beta-lactamase strains were isolated from clinical samples,and the genomic DNA was extracted. Genomic ampC was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and ligated into pMD19-T vector. The homology and consensus sequences were analyzed by comparison. Related primer was designed according to the consensus sequence and was used to detect the genomic ampC.

Results

41 out of the 57 clinical isolates were identified to contain genomic ampC, and their sequences were successfully obtained. The consensus sequences of the genomic ampC from Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Acinetobacter baumannii and Enterobacter aerogenes had high species homology respectively, but the homology between the different species was rather low. The designed primers according to the species consensus sequences could detect the genomic ampC.

Conclusions

The consensus sequences of the genomic ampC from Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Acinetobacter baumannii and Enterobacter aerogenes have high species homology respectively. The species primers from the consensus sequences can be used to identify the genomic ampC.

Keyword: AmpC beta-lactamase; Genomic ampC; Consensus sequence

随着β -内酰胺类抗菌药物的广泛应用, 细菌产各种β -内酰胺酶导致的耐药现象日趋严重, 尤其以超广谱β -内酰胺酶(ESBLs)和AmpC β -内酰胺酶(简称AmpC酶)最为常见, 已成为当今抗感染治疗的主要问题 [1~3]。AmpC酶是由肠杆菌科细菌和/或铜绿假单胞菌产生的一类主要作用于头孢菌素类抗菌药物, 且不被克拉维酸所抑制的耐药酶。AmpC酶大部分由染色质介导, 部分由质粒介导[1~3]。AmpC酶的产生由其染色质或质粒上的结构基因— — ampC所决定。到目前为止, 不同种类的产酶细菌, 其染色质上ampC的同源性尚不完全清楚。作为分子生物学检测方法的基础, ampC基因的研究已经受到人们的关注[4, 5]。本研究就临床常见的AmpC酶产酶菌株中染色质ampC做一分析探讨。

材料和方法
一、试验菌株

收集2006年1月至2007年12月间从华东医院医院感染患者样本中分离培养出的革兰阴性杆菌。所有菌株经VETEK(法国生物梅里埃公司)鉴定到种, 并用头孢西丁初筛试验和头孢西丁三维试验[6~8]筛选出产持续高产AmpC酶的细菌57株, 其中大肠埃希菌13株, 阴沟肠杆菌18株, 肺炎克雷伯菌5株, 鲍曼不动杆菌11株, 铜绿假单胞菌8株, 产气肠杆菌2株。

二、主要试剂

细菌染色质DNA抽提试剂盒为Sigma公司产品, 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷(X-Gal)、异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)、聚合酶链反应(PCR)扩增试剂盒、pMD19-T载体购自Takara公司, PCR产物纯化试剂盒购自博大泰克公司, 100 bp DNA ladder和感受态细胞DH5α 购自天根公司。

三、方法

1. 细菌染色质DNA提取 参照Sigma公司产品操作手册进行。

2. ampC基因全序列的PCR扩增 PCR扩增引物由上海生工公司合成。相应引物和参考序列见表1。PCR反应体系中含10× 长片段(LA)PCR缓冲液(含Mg2+)5 μ L、LA Taq DNA聚合酶2.5 U、dNTP各200 μ mol/L、引物各1 μ mol/L , 模板约10 ng, 灭菌双蒸水加至50 μ L。扩增条件为:94 ℃预变性5 min; 94 ℃ 45 s, 60 ℃ 45 s, 72 ℃ 80 s, 共30个循环; 72 ℃延伸10 min; 4 ℃保存。取25 μ L PCR 扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳, 切取含1.1 kb DNA 片段的琼脂糖凝胶进行回收纯化。

表1 不同种类细菌的引物

3. pMD19-T/ampC重组质粒的构建 参照文献[9]完成。将约1.1 kb的PCR 产物片段连接入pMD19-T载体, 转化入大肠埃希菌感受态细胞DH5α , 转化菌液接种至含X-Gal 40 μ g/mL、IPTG 0.2 μ mol/mL、氨苄西林100 μ g/mL的Luria-Bertani(LB, 溶菌肉汤)琼脂平皿, 37 ℃孵育过夜。将过夜筛选平皿上生长的单个白色菌落编号后接种至含氨苄西林100 μ g/mL的LB肉汤中, 震荡过夜, 提取重组质粒作为模板, 再以对应的ampC基因扩增引物进行PCR , 对重组子的插入片段长度进行鉴定。PCR反应体系和扩增条件同前。扩增出约1.1 kb DNA片段的视为阳性克隆, 即可能含有目的ampC 基因。

4. ampC基因的测序和序列分析 由上海鼎安生物科技有限公司完成对pMD19-T/ampC重组质粒中插入片段的测序。测序引物为M13F(-47)和M13R(-48)。同源性分析和共同序列比对使用DNAsis V2.9(Hitachi Software Engine)。菌种特异性的引物使用Primer Premier 5.0设计。

5. 菌种特异性染色质ampC的PCR引物设计 根据上述基因序列的测序结果, 利用DNAsis筛选出各种细菌的共同序列, 选择其中较特异的部分作为PCR的目的片段, 设计菌种特异性的PCR引物。

6. 菌种特异性染色质ampC的PCR引物验证试验 采用双盲法, 用设计出的4种菌种特异性的PCR引物分别扩增各种已知细菌的ampC基因, 其中大肠埃希菌55株, 阴沟肠杆菌53株, 鲍曼不动杆菌48株, 产气肠杆菌44株, 共200株。通过检测目的条带的有无和大小来验证细菌染色质ampC基因和已知细菌的种类。

结 果
一、57株细菌染色质DNA PCR克隆ampC基因的结果

57株细菌染色质DNA扩增ampC产物, 通过1.5%琼脂糖凝胶电泳显示, 41株可见清晰、惟一的条带, 大小在1 100 bp左右, 另外16株则为阴性, 见表2。

表2 PCR克隆染色质ampC的结果
二、染色质ampC基因的同源性分析

对GenBank报道的各种细菌参考序列进行分析, 阴沟肠杆菌(AY302261)和产气肠杆菌(AY171096)的染色质ampC同源性最高, 为73.2%; 鲍曼不动杆菌(EU118266)和铜绿假单胞菌(AB211126)的同源性最低, 为47.8%, 见表3。

表3 大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和产气肠杆菌已报道染色质ampC的同源性比对结果(%)

根据各种细菌测序结果与参考序列比对的结果, 大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌和产气肠杆菌各自的染色质ampC具有较高的同源性, 均在90.0%以上, 而肺炎克雷伯菌的同源性相对较低, 为74.9%, 见表4。

表4 大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌和产气肠杆菌临床分离菌株的染色质ampC与各自已报道染色质ampC的同源性比对结果
三、菌种特异性染色质ampC的PCR引物设计和验证结果

由于大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌和产气肠杆菌各自的染色质ampC均具有较高的同源性, 利用DNAsis筛选出各种细菌的共同序列后, 选择其中较特异的部分作为PCR的目的片段, 并且设计出菌种特异性的PCR引物, 见表5。

表5 菌种特异性的染色质ampC扩增引物
四、菌种特异性染色质ampC的PCR引物鉴定结果

用上述4种种特异性的PCR引物分别扩增200株已知细菌的ampC基因。总的菌种符合率为91.00%, 其中鲍曼不动杆菌的符合率最高, 为97.92%; 大肠埃希菌的符合率最低, 为83.64%; 阴沟肠杆菌的符合率为92.45%, 产气肠杆菌的符合率为90.91%。

讨 论

目前国内外已经有很多关于AmpC酶检测方法的报道[6~8], 但都存在不同程度的缺陷。氟氯西林(FCC)双抑制剂扩散协同试验等纸片扩散法易受到抗菌药物诱导的影响, 不能完全判断诱导酶与非诱导酶; 而目前公认的检测持续高产AmpC酶的经典方法— — 头孢西丁三维试验操作繁琐、费时, 难以在临床实验室常规开展。新兴的分子生物学方法, 利用PCR特异快速地扩增ampC基因, 从而可以简单地通过琼脂糖凝胶电泳直观地观察到质粒型或染色质型ampC基因的存在, 为确定细菌耐药机制和产酶类型提供依据[4, 5]。

以往的PCR克隆ampC基因往往都是直接将细菌热裂解后取总DNA为模板, 虽然操作方便, 但常常含有质粒DNA成分, 导致PCR时有可能出现假阳性的情况。本研究以细菌染色质为模板, 使用菌种特异性的引物克隆基因组ampC, 可以大大降低假阳性的可能。根据报道的序列, 该5种细菌染色质DNA ampC的编码区大小在1 100~1 200 bp之间。

编码AmpC酶的结构基因— — ampC存在于产酶菌株的染色质或质粒中, 张永龙等[10]曾报道55株临床分离的阴沟肠杆菌中有51株含有ampC结构基因。本试验57株细菌中41株染色质上克隆出ampC基因序列(比例为71.93%), 其中鲍曼不动杆菌和产气肠杆菌染色质上均含有ampC基因序列, 其次为阴沟肠杆菌和肺炎克雷伯菌, 而铜绿假单胞菌和大肠埃希菌染色质上含ampC基因的比例较低, 可能为质粒所介导。

近年来, 由于ampC基因开始在耐药质粒中出现, 表现为无阻遏非诱导的持续高产状态。这使得原本没有产AmpC酶能力的细菌可以通过耐药质粒获得高产AmpC酶的能力, 从而造成了细菌耐药现象日趋严重, 因此人们对质粒型ampC基因进行了广泛深入的研究。Pé rez-Pé rez等[11]通过比对质粒型ampC基因的同源性和共同性, 设计了质粒类型特异的6对引物, 从而发明了目前检测质粒型ampC基因最权威的多重PCR。这种方法对质粒型ampC基因进行系统、全面的研究, 因而在国内也得到了比较广泛的应用[12~14], 这也就使我们对染色质ampC基因的同源性及其共同序列产生了浓厚的兴趣。

国内外已经有关于阴沟肠杆菌[15]和铜绿假单胞菌[16, 17]染色质ampC检测的报道, 其中也使用了菌种特异性的引物。但根据我们试验得到的初步结果, 报道的阴沟肠杆菌的正向引物并不能与我们比对出的阴沟肠杆菌的共同序列完全匹配, 因此我们对该正向引物做了部分修正。在后续的试验中, 结果显示该对引物能够非常特异的检测出染色质ampC基因。而报道的铜绿假单胞菌的引物检测的是ampR-ampC片段, 包括ampR结构基因、ampC启动子以及一部分ampC结构基因, 因此存在一定的局限性。

据我们所知, 目前尚没有对各种细菌染色质同源性的系统分析。我们根据对GenBank已经报道的各种细菌参考序列的分析, 阴沟肠杆菌(AY302261)和产气肠杆菌(AY171096)的染色质ampC同源性最高, 为73.2%; 鲍曼不动杆菌(EU118266)和铜绿假单胞菌(AB211126)的同源性最低, 为47.8%。根据各种细菌测序结果与参考序列比对的结果, 大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌和产气肠杆菌各自的染色质ampC具有较高的同源性, 均在90.0%以上, 而肺炎克雷伯菌的同源性相对较低, 为74.9%。

用上述4种种特异性的PCR引物扩增了200株各种待检细菌的ampC基因, 符合率较高(总的符合率为91.00%, 其中鲍曼不动杆菌的符合率最高, 为97.92%; 大肠埃希菌的符合率最低, 为83.64%; 阴沟肠杆菌的符合率为92.45%, 产气肠杆菌的符合率为90.91%), 表明本试验设计的4种引物具有较高的特异性和覆盖面, 可用于快速检测待检细菌染色质ampC基因。

不管是染色质还是质粒介导的AmpC酶, 都需要产酶的结构基因— — ampC基因。与质粒型ampC基因不同, 染色质ampC基因的表达还要受到ampR、ampG和ampD等调控基因的调控[1~3], 因此仅仅检测到染色质ampC基因不能代表细菌产染色质介导的AmpC酶, 需要与检测其他3个调控基因相结合, 才能从一个完整的分子生物学角度来阐释细菌是否产AmpC酶及产酶类型。

总之, 本研究第1次系统地报道了检测染色质ampC基因的分子生物学新方法, 并且包括了临床常见产AmpC酶的菌种类型。与多重PCR检测质粒型ampC基因相似, 使用菌种特异性的PCR引物, 不仅可以特异地检测到染色质ampC基因的有无, 而且可以通过条带大小来区别细菌的种类; 在与多重PCR联合使用的情况下, 可以对细菌的产酶类型做出大致的判断, 因此具有较大的潜在临床应用价值。

The authors have declared that no competing interests exist.

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