引用本文
汪萍, 沈立松, 张冬青. BAFF及其受体在多发性骨髓瘤中的表达. 25(6): 442-446
WANG Ping, SHEN Lisong, ZHANG Dongqing. Expression of BAFF and its receptors with multiple myeloma. Labratory Medicine, 25(6): 442-446  
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《检验医学》编辑部
BAFF及其受体在多发性骨髓瘤中的表达
汪萍1, 沈立松1, 张冬青2
1. 上海交通大学医学院附属新华医院检验科,上海 200092
2. 上海交通大学医学院免疫研究所,上海 200025

作者简介：汪萍,女,1974年生,学士,副主任技师,主要从事临床生化检验工作。

基金:上海市科委重点项目（07JC14033）、国家自然基金（30471593）资助
摘要
目的

通过测定B淋巴细胞刺激因子(BLyS)及其受体在单克隆丙球蛋白血症中的表达水平,探讨BLyS及其受体与多发性骨髓瘤(MM)的关联性。

方法

流式细胞术对9例不同型别的MM患者及11例良性单克隆丙球蛋白血症(MGUS)患者,以及7名正常人外周B淋巴细胞表面BLyS及其3种受体BLyS受体(BAFFR)、穿膜蛋白活化物(TACI)、B细胞成熟抗原(BCMA)进行分析。并运用酶联免疫吸附试验(ELISA)对20例MM患者、23例MGUS患者、20名健康者血清BAFF水平进行检测。

结果

MM、MGUS及正常对照组外周B淋巴细胞膜表面均表达BAFFR,但各组间差异无统计学意义( P>0.05)。膜表面受体结合BAFF情况比较,各组间差异有统计学意义( P<0.05)。MM组结合能力最强。TACI 在MM及MGUS组低表达,其中MM组与正常对照组比较差异有统计学意义( P<0.05)。胞浆BCMA高表达, MM组与正常对照组或与MGUS组比较差异均有统计学意义( P<0.05)。血清BLyS水平MM组高于MGUS组( P<0.05),MGUS组高于正常对照组( P<0.05)。

结论

BLyS及其受体BAFFR、TACI、BCMA可能与MM的发病机制有关。血清BLyS可作为MM的实验室辅助诊断指标之一。

关键词: B淋巴细胞刺激因子; 多发性骨髓瘤; 表达
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)06-0442-05
Expression of BAFF and its receptors with multiple myeloma
WANG Ping1, SHEN Lisong1, ZHANG Dongqing2
1. Department of Clinical Laboratory, Xinhua Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200092, China
2. Shanghai Institute of Immunology, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200025, China
Abstract
Objective

To determine the expression levels of B-lymphocyte stimulator(BLyS)and its receptors in monoclonal gammopathy, and investigate the relationship of BLyS and its receptors with multiple myeloma (MM).

Methods

BLyS and its receptors B-cell activation factor receptor (BAFFR), transmembrane activator and CAML interactor (TACI) and B-cell maturation antigen (BCMA) levels from peripheral B lymphocytes of 9 MM patients, 11 monoclonal gammopathy of undetermined significance (MGUS) patients and 7 healthy controls were determined by flow cytometry. Among 20 MM patients, 23 MGUS patients and 20 healthy controls, their serum BAFF levels were determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

Results

The expression of BAFFR in peripheral B lymphocytes was high. There was no significant difference between MM patients, MGUS patients and healthy subjects (P>0.05). There were significant differences in membrane surface receptor (P<0.05), and MM patients had high binding ability. The MM and MGUS patients had significant low expression level of TACI, which the results had statistical difference between MM patients and healthy controls (P<0.05). The expression of BCMA was high, and there were significant difference between MM patients and healthy controls or MGUS patients (P<0.05). The level of BLyS in MM patients was higher than that of MGUS patients(P<0.05). The level of MGUS patients was also higher than that of controls (P<0.05).

Conclusions

BLyS receptors BAFFR, TACI and BCMA may be related with the pathogenesis of MM, and serum BLyS may serve as a biomarker of MM in clinical laboratory.

Keyword: B-lymphocyte stimulator; Multiple myeloma; Expression

多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是一种起源于B细胞系并能够产生单克隆免疫球蛋白的恶性增生性疾病, 至今尚不可治愈。其发病率在血液系统的恶性疾病中占10%~15%, 已高居第二位, 仅次于淋巴瘤, 在所有的恶性肿瘤中占1%。因此, 愈来愈需要有效的治疗手段。而新的治疗方案产生的重要部分是基于对发病机制的理解, 肿瘤细胞通过抗凋亡而延长恶性B细胞的生存和肿瘤细胞在骨髓中的积聚, 从而与免疫球蛋白生成增加这一生物学特征高度相关。目前对于调节恶性B细胞的生存和免疫球蛋白的产生的相关机制不明。

BLyS又称肿瘤坏死因子(TNF)家族的B细胞活化因子(BAFF), 是在单核细胞, 巨噬细胞, 树突状细胞, 中性粒细胞上表达的一种TNF家族成员之一[1~3], 其在B细胞维持自稳、免疫耐受以及恶变中起着重要的作用 [4] 。早期有关BLyS在B细胞的生理学方面作用的研究提示BLyS共刺激B细胞的增殖和免疫球蛋白的分泌。目前确定的BLyS的3种受体分别是:B细胞成熟抗原(B-cell maturation antigen, BCMA)、穿膜蛋白活化物(transmembrane activator and CAML interactor, TACI)、BLyS受体(B-cell activating factor receptor, BAFFR)。尤其, BAFFR对外周B细胞的生存极其重要[5]。BCMA和BAFFR主要在B细胞中表达, 而TACI在B细胞和活化的T细胞表达。目前证实BAFFR是BLyS的主要受体, 维持外周血B细胞自稳并特异性结合BLyS, 而BCMA和TACI也可结合增殖诱导配体(a proliferation inducing ligand, APRIL)。BlyS-/-小鼠和BAFFR信号不足小鼠(A/WySnJ)(携带BAFF-R的突变基因, 在淋巴滤泡边缘区和次级淋巴器官缺乏B淋巴细胞)或BAFF-R-/-小鼠之间的研究进一步证实BAFF-R是BLyS的主要受体[6]。

BLyS对B细胞的生存和自稳具有重要作用, 它不仅可与恶性B细胞结合, 同时还可能与其受体共同参与MM中恶性B细胞的生存及生长过程。BLyS通过正常B细胞调节Ig的产生, BLyS血清水平的升高和Ig升高的联系提示这一分子在MM发病机制中的意义。因此本研究旨在确定BLyS及受体在MM患者B细胞中的表达, 以及BLyS水平与MM的关联性。同时初探MM患者BLyS受体配体的功能性作用。

材料和方法
一、研究对象

标本来自上海交通大学医学院附属新华医院血液、肾脏内科门诊及住院患者, 其中MM 23例, 男12例, 女11例, 年龄57~85岁。MGUS 20例, 男11例, 女 9例, 年龄55~87岁。诊断符合2003年国际骨髓瘤工作组制定的MM、MGUS诊断标准[7]。年龄匹配正常对照30名, 男17名, 女13名, 年龄55~80岁。来自新华医院体检中心正常人群。采集静脉血4 mL, 其中2 mL乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝, 2 mL分离血清-80 ℃保存。

二、试剂和方法

1. 试剂和设备 淋巴细胞分离液为上海华精生物高科技有限公司产品。PE-抗人CD257(BLyS)、(FITC)-抗人CD268(BAFFR)、(PE)-抗人CD267(TACI)、BCMA /FITC-抗(RAT) IgG1和相对应的同型对照鼠IgG1K、兔抗兔IgG、鼠IgG1K、兔IgG2aK由Biolegend及Abcam公司提供。固定/破膜剂由eBioscience 公司提供。BLyS-酶联免疫吸附试验(ELISA) kit由R& D公司提供。流式细胞仪(FCM)为美国BD公司FACS Calibur。酶标仪为美国Thermo 公司 提供的MULTISKAN ASCENT。

2. 细胞染色 分离外周血单个核细胞(PBMC), 以磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤。0.5× 106细胞在含有0.5%的牛血清白蛋白(BSA)的PBS备用, 先加入CD19-PC7、CD45-PC5各20 μ L后加20 μ L PE-BLyS, 或20 μ L FITC-BCMA、FITC-BAFFR、PE-TACI室温避光孵育30min, PBS洗涤, 1 500 r/min(离心半径为15 cm)离心5 min, 弃上清液, 加PBS重悬待测。胞浆BCMA染色加CD19、CD45孵育30 min后加100 μ L破膜1液10 min, 洗涤后加100 μ L破膜2液10 min, 加20 μ L FITC-BCMA孵育30 min, PBS洗涤后重悬待测。同时分别做同型对照。使用FACS校准(Becton Dickinson, SanJose, CA)。

3. FCM分析 用FlowJo软件获取10 000个细胞数据进行分析。以CD19、CD45设门于B淋巴细胞, 分析细胞膜表面BLyS、TACI、细胞浆BCMA的表达以及BAFF与受体的结合情况。

4. ELISA 试剂、样本、标准品于室温。样本1∶ 3稀释, 每孔加100 μ L RD1-72稀释液, 然后加50 μ L标准品、质控品、稀释后的样本, 室温孵育2 h后洗涤, 加200 μ L酶标抗体, 室温孵育2 h洗涤后加200 μ L底物, 室温孵育30 min, 避光。加 50 μ L中止液, 450 nm波长读数。

三、统计学方法

实验数据以 x-± s表示, 采用SPSS12.0统计软件分析。组间比较采用t检验, P< 0.05为差异有统计学意义。

结 果
一、BLyS及受体BAFFR、TACI、BCMA在MM中的表达

为了明确BLyS受体-配体系统在MM中的相关性, 我们检测了9例MM患者(其中IgG型3例, IgA型5例, IgD型1例), 11例MGUS患者(其中IgG型9例, IgA型1例, IgM型1例), 7名正常人外周B淋巴细胞结合可溶性BLyS的能力和已知BLyS 3种受体BAFFR、BCMA、TACI的表达情况, 见图1。

图1 外周血B细胞结合可溶性BLyS的能力以及BAFFR、BCMA、TACI的表达

以平均荧光强度(MFI)比较发现MM、MGUS及正常对照组均结合BLyS, MM组与正常对照组或与MGUS组比较差异均有统计学意义(P< 0.05)。而B淋巴细胞表面BAFFR表达在3组间比较差异无统计学意义(P> 0.05)。TACI在MM及MGUS组低表达, 其中MM组与正常对照组比较差异有统计学意义(P< 0.05)。B淋巴细胞膜表面BCMA低表达, 胞浆BCMA(cBCMA)高表达, MM组与正常对照组或与MGUS组比较膜表面BCMA差异无统计学意义(P> 0.05), MM组与正常对照组或与MGUS组比较cBCMA差异均有统计学意义(P< 0.05), 见表1。

表1 MM、MGUS患者 BLyS及受体表达与正常对照组比较[( x-± s), MFI]
二、血清游离BLyS水平在MM患者中升高

由于BLyS在B细胞的发育、生存和自稳中的重要作用, 我们推测在MM患者中的血清BLyS水平与年龄、性别匹配对照组相比可能升高。我们用ELISA方法检测了MM患者的血清样本, 并与正常对照组相比较。MM患者的血清BLyS水平(6.0± 1.88) ng/mL显著高于正常对照组水平(2.52± 0.71 ng/mL, P< 0.05), 高于MGUS组水平(3.24± 0.82 ng/mL, P< 0.05), 见表2。

表2 MM、MGUS组血清BLyS与正常对照组比较( x-± s)
讨 论

在正常情况下, 淋巴细胞必须严格调节生长和凋亡以提供适量的免疫球蛋白抵抗感染。BLyS在维持正常B细胞发育和自稳中起重要作用。在正常B细胞中, BLyS信号来源于浆细胞的分化, 而BLyS引出免疫球蛋白的类别转化。而且, 浆细胞的分化也与BLyS的受体之一BCMA的上调有关。BLyS显示增强了来源于记忆B细胞的浆母细胞的生存[9]。MM是临床常见的以恶性浆细胞(源于前B细胞)在骨髓中的增殖和积聚为特征的一种致命的免疫增殖病[10]。目前, 有关抗凋亡因子和生长因子在MM患者中改变的报道较多, 但对于MM的发生和发展起关键作用的因素仍然不明。

BLyS受体缺陷小鼠的研究发现, BCMA-/-及TACI-/-小鼠与BLyS-/-小鼠存在显著差异, 他们对B细胞影响很小。而BLyS-/-小鼠和BAFFR信号不足小鼠(A/WySnJ)(携带BAFFR的突变基因, 表型与BLyS-/-小鼠相似, ), 在淋巴滤泡边缘区和次级淋巴器官缺乏B淋巴细胞。BAFFR-/-小鼠之间的研究则进一步证实BAFFR是BLyS的主要受体[6]。在TACI缺陷小鼠中发现B细胞的积聚和免疫球蛋白的升高, 因此认为在B细胞的自稳和免疫反应中起负调节作用。有关BCMA-/-小鼠的研究显示TACI主要与体液免疫相关, 而BCMA对B细胞的作用不明。

恶性浆细胞的异常增殖被认为是引起MM发生、发展的中心环节。研究显示BLyS及其受体调节浆细胞的增殖及活性[11, 12]。因此, BLyS及其受体在MM的发病机制中可能起某种作用。考虑到MM细胞大多存在于骨髓中, 外周血中与其相关的B淋巴细胞可能提供线索。据此, 我们检测MM患者的血清BLyS浓度以及外周血B淋巴细胞的BLyS及其受体的表达水平。结果显示MM患者的血清BLyS浓度升高, 且患者B淋巴细胞膜表面BLyS高表达, MGUS患者BLyS表达与正常组比较差异有统计学意义, 提示MM、MGUS患者B淋巴细胞结合BLyS能力提高, 而MM患者的结合能力更高。MGUS被认为是MM的前期, 当患者恶变或者MM患者恶性浆细胞异常增殖, 可能引起BLyS结合BLyS受体结合能力增强; 或者其结合能力的提高可能促进恶性病变, 从而导致浆细胞异常增殖。B细胞膜表面TACI相对低表达, 而胞浆BCMA表达水平显著升高, 提示在MM发病机制中前者可能有负调节作用, 而后者可能有正调节作用。尽管BAFFR是BLyS的主要受体, 但在良、恶性患者及正常人的B细胞表面表达相近。可能在MM中BLyS升高, BAFF与该受体特异性结合, 导致BAFFR表达并不高。而TACI的表达下调是否与恶性浆细胞的异常增殖有关, 是否BLyS的过度表达导致BCMA表达上调或TACI表达下调将有待于进一步的研究。

BLyS的升高可发生于B细胞的炎症和恶性疾病中。然而, 其是否影响恶性B细胞的生长和存活仍然未明。以往报道显示BLyS受体在MM和非何杰金淋巴瘤(NHL)中的表达。发现MM骨髓样本中BLyS的存在, 且与正常骨髓相比BLyS表达增加[13, 14]。认为小鼠骨髓微环境中的干细胞是BLyS的主要资源[15]。但肿瘤微环境中究竟哪一组分对BLyS的表达起作用仍然未明。

MM患者的血清BLyS浓度和BLyS及其受体在B淋巴细胞的表达提示BLyS及其受体在MM的发病机制中起一定的作用。MM与MGUS患者血清BLyS水平的差异提示MGUS作为MM的恶变前期, 其血清BLyS水平可能预测MGUS的转归, 也进一步支持了BLyS在MM中的重要作用这一假说。而我们研究的正常对照组的BLyS水平(2.52ng/mL)与鞠少卿等[8]报道2.7ng/mL的值相近。而有关MGUS患者的血清BLyS水平目前尚无相关报道。我们研究结果提示良、恶性单克隆丙球蛋白血症患者的血清BLyS水平存在差异, 可能成为临床实验室鉴别诊断的指标之一。我们仅仅检测了BLyS血清浓度、BLyS及其受体在外周血B细胞的表达水平。旨在通过一个侧面初探由多信号通路导致的较为复杂的MM发病机制。对于BLyS及其受体在MM的发病、发展及预后中的作用有必要做更深入的研究工作。MGUS是一种常见的免疫增生性疾病, 临床上常以单克隆蛋白质的出现为主要特征。我们认为MM患者的血清BLyS水平显著升高。另外, 无论良、恶性MGUS, 我们发现在出现M蛋白峰的患者与正常对照组的血清BLyS水平存在差异。而BLyS及其受体在MGUS患者的不同表达是否与其不同免疫分型有关还有待于进一步扩大样本。在血清或骨髓微环境中的BLyS水平的升高可能促进恶性MM细胞的生存和生长, 阻断该受体可能成为一种有效的免疫干预的手段。

The authors have declared that no competing interests exist.

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