引用本文
任伟宏, 赵素玲, 李延卿, 赵志娟, 孙蕾, 熊慧, 陶慧卿. 乙型肝炎患者血清中HBV cccDNA与HBV DNA、 HBsAg和HBeAg定量关系的分析. 25(6): 438-441
REN Weihong, ZHAO Suling, LI Yanqing, ZHAO Zhijuan, SUN Lei, XIONG Hui, TAO Huiqing. Analysis of quantitative correlation between HBV cccDNA with HBV DNA, HBsAg and HBeAg in serum of hepatitis B patients. Labratory Medicine, 25(6): 438-441  
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乙型肝炎患者血清中HBV cccDNA与HBV DNA、 HBsAg和HBeAg定量关系的分析
任伟宏1, 赵素玲1, 李延卿1, 赵志娟1, 孙蕾1, 熊慧2, 陶慧卿2
1. 河南中医学院第一附属医院检验科, 河南 郑州 450000
2. 国家人类基因组南方研究中心,上海 201203

作者简介：任伟宏,男,1969年生,硕士,副主任技师,主要从事生物化学及分子生物学研究。

摘要
目的

定量检测乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)、HBV DNA、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎e抗原(HBeAg)并分析其相互关系,探讨定量检测血清中HBV cccDNA的临床应用价值。

方法

随机选取HBV感染者83例,采用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测血清中HBV cccDNA及HBV DNA,同时采用化学发光法定量检测血清中HBsAg和HBeAg。

结果

83例患者中HBV DNA阳性62例,其中HBV DNA载量≥105拷贝/mL者40例,血清HBV cccDNA阳性28例(70.00%);HBV DNA载量<105拷贝/mL者22例,血清HBV cccDNA阳性2例(9.09%),不同DNA载量组HBV cccDNA差异有统计学意义( P<0.01)。HBeAg阳性组和阴性组HBV cccDNA阳性率分别为70.00% (28/40)和4.65% (2/43),两组差异有统计学意义( P<0.01)。HBV cccDNA定量值与HBV DNA、HBsAg呈正相关( P<0.01)。

结论

血清中HBV cccDNA水平可同时反应血清HBV DNA和HBsAg水平,血清HBV cccDNA含量可作为观察HBV复制情况和评价抗病毒疗效的相关血清指标。

关键词: 乙型肝炎病毒DNA; 共价闭合环状DNA; 乙型肝炎表面抗原; 乙型肝炎e抗原
中图分类号:R446.62 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)06-0438-04
Analysis of quantitative correlation between HBV cccDNA with HBV DNA, HBsAg and HBeAg in serum of hepatitis B patients
REN Weihong1, ZHAO Suling1, LI Yanqing1, ZHAO Zhijuan1, SUN Lei1, XIONG Hui2, TAO Huiqing2
1. Department of Clinical Laboratory,the First Affiliated Hospital of Henan University of Traditional chinese Medicine, Henan Zhengzhou 450000,China
2. Chinese National Human Genome Center at Shanghai, Shanghai 201203, China
Abstract
Objective

To analyze the correlation between Hepatitis B virus (HBV) covalently closed circular DNA (cccDNA), HBV DNA, hepatitis B surface antigen (HBsAg)and hepatitis B e antigen (HBeAg) in serum of hepatitis B patients, and explore the clinical application value of HBV cccDNA quantitative detection.

Methods

83 cases of HBV-infected patients were enrolled in this study. Serum HBV cccDNA and HBV DNA were determined by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR), while HBsAg and HBeAg were detected by chemiluminescence immunoassay.

Results

Among 83 cases, 62 cases were HBV DNA positive. Among them, 40 cases were HBV DNA load ≥105 copies/mL, 28 cases (70.00%) were HBV cccDNA positive; 22 cases were HBV DNA load < 105 copies/mL, and 2 cases (9.09%) were HBV cccDNA positive. There was statistical significance in HBV cccDNA load between groups with different HBV DNA loads (P<0.01). The positive rates of HBV cccDNA in HBeAg positive and negative patients were 70.00% (28/40) and 4.65% (2/43) respectively. There was statistical difference (P<0.01). The quantitative value of HBV cccDNA was correlated positively with HBV DNA and HBsAg (P<0.01).

Conclusions

The serum level of HBV cccDNA is positively correlated with the levels of HBV DNA and HBsAg, and can reflect HBV replicative status and the efficacy of antiviral drugs.

Keyword: Hepatitis B virus DNA; Covalently closed circular DNA; Hepatitis B surface antigen; Hepatitis B e antigen

目前已明确肝细胞核内乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)水平是HBV复制最特异的指标, 其准确性超过目前常用的HBV DNA检测。然而通过肝活检来监测患者肝组织中的HBV cccDNA水平还存在着一定困难, 相比之下定量检测血清中HBV cccDNA较方便易行。但对血清中HBV cccDNA与其他血清指标的关系及其临床价值尚不十分清楚。本研究选择了83例HBV感染者, 定量检测其血清中HBV cccDNA、HBV DNA、乙型肝炎表面抗原(HBsAg) 和乙型肝炎e抗原(HBeAg)含量并分析其相关关系, 初步探讨定量检测血清中HBV cccDNA的临床应用价值。

材料和方法
一、研究对象

随机选自2008年7月间在河南中医学院第一附属医院门诊或住院治疗的HBV感染患者83例, 其中男48例, 女35例, 年龄17~72 岁。诊断按2000 年西安第10次全国传染病和寄生虫病会议诊断标准, 对于符合入选标准的患者, 在获取知情同意后留取血清标本, 保存于-80 ℃冰箱内待测。

二、检测方法

1. 血清中HBV DNA提取 取50 μ L HBV DNA浓缩液, 加入0.5 mL离心管中, 后加入50 μ L待测血清, 振荡混匀后4 ℃静置5 min, 以15 000 r/min(离心半径为7 cm)离心10 min, 吸弃上清。加入20 μ L裂解缓冲液, 剧烈振荡至无沉淀后短暂离心, 沸水浴10 min, 15 000 r/min(离心半径为7 cm)离心5 min, 取上清液4 μ L做HBV DNA定量检测。另取上清液5 μ L加入5 μ L ATP-Dependent Dnase液混匀, 37 ℃浴温1 h, 后70 ℃灭活30 min, 灭活后的标本用于HBV cccDNA的检测, 试剂由上海申友技术有限公司提供。

2. HBV DNA载量检测 采用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR), 试剂盒购于上海申友技术有限公司, 仪器采用美国MJ公司 opticon 2TM 型全自动FQ-PCR仪。操作严格按说明书进行, 取检测结果对数值进行统计学分析。

3. HBV cccDNA的提取纯化 选用质粒-安全的三磷酸腺苷(ATP)依赖的核酸酶(plasmid-safeTM ATP-dependent DNase)酶切单链核酸或有缺口的双链DNA, 对酶切后的产物进一步纯化。

4. HBV cccDNA的定量检测 我们设计了跨越松弛环状的双链DNA(relaxed circular DNA, rcDNA)正链和负链上2个缺口的引物, 上游引物:5'-CCTCTTCATCCTGCTGCT-3'(nt1551-1571); 下游引物:5'-AACTGAAAGCCAAACAGTG-3'(nt1991-2011)。TaqMan探针设计在负链缺口的下游[5'-FAM-TTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTG-TGB-3'(nt1880-1900)]。PCR反应程序:保温(42 ℃和94 ℃各5 min), 40次循环(94 ℃ 10 s, 55 ℃ 20 s, 72 ℃ 30 s), 保温(37 ℃恒温)。PCR产物经测序证实为目的片段。试剂由上海申友技术有限公司提供。

5. 血清HBsAg和HBeAg定量检测 采用化学发光定量检测技术, 试剂购于郑州安图生物工程有限公司, 仪器采用郑州安图生物工程有限公司Lumo型化学发光检测仪, 操作严格按说明书进行, 取检测结果对数值进行统计学分析。

6. HBV标志物(HBV-M) HBsAg、乙型肝炎表面抗体(抗-HBs)、HBeAg、乙型肝炎e抗体(抗-HBe)、乙型肝炎核心抗体(抗-HBc) 检测分别编号为1、2、3、4、5, 3种主要模式为1、3、5 阳性, 1、4、5 阳性, 1、5 阳性)。HBV-M采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测, 试剂盒为科华生物工程公司产品。

三、统计学方法

应用SPSS 13.0统计软件进行统计分析, 计量资料差异性比较采用t检验, 计数资料差异性比较采用χ 2 检验, 相关系数(r)检验采用查表法, P< 0.05为差异有统计学意义。

结 果
一、不同HBV DNA载量水平的HBV感染者血清中 cccDNA检出情况

83例患者中HBV DNA阳性62例, 其中HBV DNA载量≥ 105拷贝/mL者40例, < 105拷贝/mL者22例, 血清HBV cccDNA阳性检出率分别为70.00%(28/40)、9.09%(2/22), 两组差异有统计学意义(P< 0.01), 血清HBV cccDNA含量(Log)位于-0.88~4.64拷贝/mL之间。

二、3种血清学模式HBV感染者血清中HBV cccDNA和HBV DNA检出情况

HBeAg阳性组和阴性组HBV cccDNA阳性率分别为70.00% (28/40)、4.65% (2/43), 两组差异有统计学意义(P< 0.01); HBeAg阳性组和阴性组HBV DNA阳性率分别为95.00% (38/40)、55.81% (24/43), 两组差异无统计学意义(P> 0.05), 见表1。

三、不同HBV cccDNA水平HBV感染者血清中HBsAg及HBeAg定量值

血清HBV cccDNA阳性组与阴性组患者相比, 血清中HBsAg、HBeAg含量水平之间差异无统计学意义(P> 0.05), 见表2。

表1 3种血清学模式HBV感染者血清中HBV DNA和HBV cccDNA检出情况
表2 血清HBV cccDNA阳性、阴性组HBsAg及HBeAg定量值水平(Log, x-± s)
四、不同HBV DNA水平HBV感染者血清中HBsAg及HBeAg定量值

血清HBV DNA阳性组患者血清中HBeAg水平高于HBV DNA阴性组, 差异有统计学意义(P< 0.01), 而HBsAg水平两组之间差异无统计学意义(P> 0.05), 见表3。

表3 血清HBV DNA阳性、阴性组HBsAg及HBeAg定量值水平(Log, x-± s)
五、血清HBV cccDNA与HBV DNA、HBsAg和HBeAg定量值的关系

血清HBV cccDNA与HBV DNA、HBsAg的定量值呈正相关关系(r=0.574、0.460, P< 0.01), 与HBeAg的定量值无相关关系(r=0.268, P> 0.05), 见图1~3。

图1 血清HBV cccDNA与HBV DNA定量值的关系

图2 血清HBV cccDNA与HBsAg定量值的关系

图3 血清HBV cccDNA与HBeAg定量值的关系

讨 论

HBV cccDNA是HBV前基因组RNAs(pre-genomeRNAs)复制的原始模板, 是HBV循环复制以及持续感染的关键因素[1], 检测HBV cccDNA 即成为评价抗病毒药物疗效的金指标[2]。同时有研究表明, HBV cccDNA不仅存在于肝脏细胞, 在外周血和体内其他器官(如肾脏、骨髓、血小板以及淋巴细胞)也被发现有HBV cccDNA的存在[3]。

目前用于检测HBV cccDNA的方法很多, 如Invader方法[4] 和嵌入式引物(chimeric primer)法[5], 但都被HBV rcDNA带来的假阳性所困扰, 因为用此2种方法检测HBV cccDNA时, 应完全去除核酸抽提物中的线性双链成分, 但做到这一点通常是很困难的。本试验采用He等[2]的设计方法, 根据HBV cccDNA和HBV rcDNA分子结构上的差异, 即HBV rcDNA负链和正链上均有缺口或缺刻, 设计了一对特异性扩增HBV cccDNA的引物, 分别杂交于1 500和2 100邻近区域(以EchoR I切点为物理起始原点) , TaqMan探针设计在负链缺口的下游, 探针含有荧光基团和淬灭基团, 杂交于负链3’ 端近缺口处。HBV cccDNA由于负链完整, 引物可延伸至探针处, 而Taq DNA聚合酶将两基团剪切分离, 从而释放荧光。理论上, 跨双缺口的方法不会因线性双链分子而产生假阳性, 但当HBV rcDNA的丰度较高时(105拷贝/PCR), 同样有假阳性出现[6]。为此, 本试验采用了Singh 等[7]设计的HBV cccDNA的提取纯化方法, 选用质粒-安全的ATP依赖的核酸酶酶切单链核酸或有缺口的双链DNA, 以减少提取物中HBV rcDNA的含量, 在此过程中HBV cccDNA的数量并无损失, 有效避免了假阳性的出现。

本研究采用上述方法检测了83例HBV感染患者血清中HBV cccDNA, 总阳性率为36.1%(30/83), 全部来自HBV DNA阳性标本, 此结果和相关报道一致[8]。进一步的数据分析发现, HBV DNA> 105 拷贝/mL时, HBV cccDNA的检出率为70.00%(28/40), 远高于HBV DNA< 105拷贝/mL组的9.09%(2/22), 表明此法测得的HBV cccDNA是总DNA的一部分, 且含量较低。

通过肝活检来监测患者肝组织中的HBV cccDNA水平还存在着一定困难, 故探讨能反映其水平的非侵入性替代检测指标具有现实意义。有研究表明, 肝内HBV cccDNA水平不仅与外周血HBV DNA及HBsAg血清水平呈显著相关[9], 同时与外周血HBV cccDNA水平有非常好的相关性[4]。这些研究显示出外周血HBV cccDNA、HBV DNA和HBsAg定量检测的临床价值。本研究从另外一个角度, 探讨了乙型肝炎患者血清中HBV cccDNA、HBV DNA、HBsAg和HBeAg定量值的相互关系, 结果显示血清HBV cccDNA与血清HBV DNA及HBsAg水平呈显著相关, 但与HBeAg定量值无相关关系。分析其原因HBeAg转阴后, HBsAg依然为阳性, 且血清HBV DNA并不一定转阴, HBV cccDNA在HBeAg阴性的标本中依然可检测到, 但在HBV DNA阴性或HBsAg阴性的标本中检测不到。由此可推测血清HBeAg水平不能反映血清HBV cccDNA水平的变化, 而HBV DNA及HBsAg水平却能较好的反映血清HBV cccDNA水平的变化。定量检测外周血HBV cccDNA既能反映HBV在肝外的复制情况, 同时也能较好地反应病毒的血清学转换情况, 可尝试作为抗病毒治疗的观察指标。但同时也应看到HBV cccDNA的检测方法的特异性和敏感性都有待进一步改进, 尚不能代替HBV DNA、HBsAg及HBeAg等常规指标的检测。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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