引用本文
林云, 吕长坤, 张乐之, 吴淑梅, 沈茜. 用中和试验评价四种ELISA试剂盒检测抗-HBe结果的准确性. 25(6): 435-437
LIN Yun, LÜ Changkun, ZHANG Lezhi, WU Shumei, SHEN Qian. Evaluation of the validity of four different anti-HBe ELISA kits by neutralization test. Labratory Medicine, 25(6): 435-437  
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用中和试验评价四种ELISA试剂盒检测抗-HBe结果的准确性
林云1, 吕长坤2, 张乐之1, 吴淑梅1, 沈茜1
1. 第二军医大学附属长海医院实验诊断科,上海 200433
2. 河南省商丘医学高等专科学校医学技术系,河南 商丘 476100

通讯作者：沈茜,联系电话：021-81873611。

作者简介：林云,男,1981年生,学士,技师,主要从事临床免疫学检验工作。

摘要
目的

用中和试验方法验证酶联免疫吸附试验(ELISA)竞争抑制法和中和竞争法检测血清乙型肝炎e抗体(抗-HBe)的性能。

方法

竞争抑制法选择A、B试剂,中和竞争法选择C、D试剂检测抗-HBe; 4种试剂结果明显差异的标本,用中和试验确认抗-HBe。

结果

4种试剂检测随机血清标本455份,其中195份(42.85%)抗-HBe结果有差异。4种试剂检测抗-HBe总阳性数279份(61.32%),其中均阳性84份(30.11%)。经中和试验确认,A、B、C试剂假阴性率为35.0%72.5%;假阳性率为31.4%~77.1%。D试剂假阳性率为37.1%,假阴性率为5.0%。

结论

ELISA一步法检测抗-HBe,4种试剂均存在一定比例的假阳性或假阴性,D试剂准确性明显优于A、B、C试剂。中和试验对于确认抗-HBe结果的准确性简便而实用。

关键词: 乙型肝炎e抗体; 酶联免疫吸附试验; 竞争抑制; 中和抑制; 中和试验
中图分类号:R446.61 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)06-0435-03
Evaluation of the validity of four different anti-HBe ELISA kits by neutralization test
LIN Yun1, LÜ Changkun2, ZHANG Lezhi1, WU Shumei1, SHEN Qian1
1. Department of Laboratory Diagnosis, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433,China
2.Department of Medical Technology, Shangqiu Medical College, Henan Shangqiu 476100, China
Abstract
Objective

To investigate the validity of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based on competitive inhibition format or neutralization inhibition format for the detection of antibody to hepatitis B e antigen (anti-HBe) by neutralization test.

Methods

Anti-HBe in 455 serum samples was detected by competitive inhibition kits (A and B) and neutralization inhibition kits (C and D), and those samples with different detection results were further confirmed by neutralization test.

Results

There were 195 out of 455 samples (42.85%) that demonstrated different detection results in the detection of anti-HBe by the 4 kits. 279 out of 455 samples(61.32%), which the results showed positive once or more than once by the 4 kits, were determined as anti-HBe positive samples. Among them, the results of 84 samples (30.11%) showed all positive by the 4 kits. After confirming by neutralization test, the false negative rate and false positive rate of A, B and C reagents varied from 35% to 70% and 30% to 70% respectively. For the D reagent, the false positive rate was 37.1% and the false negative rate was 5.0%.

Conclusions

All the 4 reagents used in our experiment for the detection of anti-HBe demonstrate a certain incidence of false positive or false negative. However, D reagent gives more precise assay results than A, B and C reagents. The neutralization test may be a simple and practical method for confirming of the validity of anti-HBe reagent kits.

Keyword: Antibody to hepatitis B e antigen; Enzyme-linked immunosorbent assay; Competitive inhibition; Neutralization inhibition; Neutralization test

尽管目前乙型肝炎病毒(HBV)感染的血清标志物检测方法较多, 但在临床上应用最多的还是酶联免疫吸附试验(ELISA)。血清乙型肝炎e抗体(抗-HBe)是HBV感染血清标志物之一, 常用竞争抑制法和中和竞争法检测。我们在临床工作中对可疑标本通常采用不同方法进行抗-HBe复检, 但在实践中却发现不同检测方法其结果差异较大。为评价竞争抑制法和中和竞争法检测抗-HBe孰优孰劣, 我们设计了本研究。

材料和方法
一、标本来源

455份血清标本随机采自长海医院门诊和住院患者。血液凝固后3 000 r/min(离心半径为8 cm)离心10 min分离血清, 当日检测。对2种方法4种试剂盒初、复检结果不一致的标本, 收集血清-40 ℃ 冰箱冻存备检。血清标本的收集和本次临床试验经长海医院伦理委员会批准。

二、检测试剂盒和检测方法

1. 血清抗-HBe检测 ELISA竞争抑制法(A和B)及中和竞争法(C和D)试剂盒购自国内4家具备国家药品食品管理局生产许可证(国药)的公司。A试剂盒生产批号为20081220; B为Z20090101; C为20090107; D为2008126443。检测步骤和结果判定标准按照试剂盒说明书进行。以试剂盒规定计算方法获得临界值(cut off值):A试剂为吸光度(A)450 nm1.19; B为A450 nm1.15; C为A450 nm1.10; D为A450 nm0.52。弱阳性定义为各检测试剂盒的cut off值减去标本检测的A值≤ 0.3, 这部分检测结果常因各种原因的变化引起差异, 可重复性较差, 故本研究中不列入中和试验研究范围。

2. 血清乙型肝炎e抗原(HBeAg)检测 试剂盒购自英科新创厦门科技有限公司(具备国药生产许可证), 生产批号为200946309。检测步骤和结果判定按照试剂盒说明书进行。室内质控品购于上海市临床检验中心, 批号为0901。试验数据的评估必须检测时室内质控品结果在控。

3. 中和试验 选择20份HBeAg检测中度阳性(A450 nm1.0~1.5)血清标本充分混匀, 取100 μ L与抗-HBe检测结果不一致血清标本100 μ L等量混匀, 为中和试验组。为消除基质效应, 选择HBV感染血清标志物检测结果均为阴性的20份血清标本充分混匀, 与上述HBeAg阳性血清100 μ L等量混匀作为对照组。2组均37 ℃水浴1 h, 再进行HBeAg复孔检测。采用Muitiskan MK3酶标仪(Thermo Electron公司)比色, 以中和试验组HBeAg A450 nm值≤ 对照组HBeAg A450 nm值的50%为抗-HBe阳性, 即该血清标本抗-HBe阳性。本试验设10份4种试剂盒检测均为抗-HBe阳性的血清为阳性对照、10份4种试剂盒检测抗-HBe均阴性的血清为阴性对照。相关计算公式:假阳性率=假阳性/(真阴性+假阳性)× 100%; 假阴性率=假阴性/(真阳性+假阴性)× 100%; 准确度(符合率)=(真阳性+真阴性)/ 总标本数 × 100%。

结 果
一、2种检测方法4种试剂盒检测抗-HBe的结果

采用A、B、C、D试剂同时检测455例血清标本抗-HBe, 其中260例(57.15%)检测结果完全相同, 195例(42.85%)检测结果出现差异。出现差异的标本中有120例标本的A450 nm值位于cut off值附近, 不进行中和试验; 另75例检测结果出现明显差异, 采用中和试验来判定结果的准确性。4种试剂盒检测阳性率见表1。其中D试剂检测阳性率最高, A、B、C试剂检测阳性率差异不明显。4种试剂盒检测均有约1/3的阳性结果处于弱阳性, 此部分是构成临床工作复检结果差异的重要来源。

表1 不同试剂抗-HBe检测阳性率[数(%)]
二、4种试剂盒检测抗-HBe阳性结果一致性分析

4种试剂盒检测抗-HBe总阳性数279份, 总阳性率为61.32%(279/455), 其中均阳性84份, 占30.11%(84/279), 其余195份血清的检测结果出现差异。3种试剂盒检测一致阳性有52份(18.64%), 且其中均有D试剂盒。D试剂单一阳性率为24.73%, 高于其他试剂(A 1.00%; B 0.00%; C 4.30%), 表明D试剂检测敏感性高于其他3种试剂盒。

三、75例抗-HBe检测有差异的血清中和试验结果

以中和试验组HBeAg A450 nm值≤ 对照组HBeAg A450 nm值的50%作为判断标本抗-HBe真阳性的标准, 否则判为真阴性。10份阳性对照血清中和试验结果全部阳性, 10份阴性对照血清结果全部为阴性, 表明此中和试验方法可信。在此基础上对75份4种试剂盒检测抗-HBe结果差异明显的血清用中和试验判断检测结果的准确性。中和试验结果表明75份结果不一致的标本中, 真阴性标本35例, 真阳性标本40例。试验结果显示, 4种检测试剂均存在一定比例的假阳性或假阴性。4种试剂盒中D试剂假阴性率显著低于其他3种试剂盒(P< 0.01), C试剂盒假阴性率显著低于A和B试剂盒(P=0.043 2、0.001 5), A和B试剂盒之间差异无统计学意义(P=0.344 4)。4种试剂盒中B与D试剂假阳性率较低, 但两者之间差异无统计学意义, A与B、D试剂差异无统计学意义, 但C试剂与B、D试剂差异有统计学意义(P=0.000 3、0.001 5)。4种试剂盒检测出的准确性结果存在差异(χ 2=29.043, P< 0.000 1)。与其他各组结果相比, D试剂盒检测抗-HBe的准确性明显高于其他试剂盒。其他3种试剂盒两两之间差异无统计学意义, 见表2。

表2 75例抗-HBe检测有差异的血清中和试验结果(%)
讨 论

抗-HBe检测有重要的临床意义。急、慢性乙型肝炎患者血清中HBeAg消失、抗-HBe的出现, 通常称为血清转换。血清转换对大部分患者表示病毒复制的停止、抗病毒治疗有效和病变的改善, 但约有20%30%慢性患者提示前C区基因发生变异[1], 有研究表明抗-HBe阳性患者仍有部分病例HBV DNA阳性及病变持续[2]。因此, 抗-HBe检测的任何不正确结果均会给患者造成精神和经济负担[3]。临床必须尽可能采用敏感性、特异性均较高的试剂盒进行检测。

由于降解的乙型肝炎核心抗原(HBcAg)与HBeAg仅有28个氨基酸不同, 存在交叉免疫原性[4], 所以目前临床检测抗-HBe多采用竞争抑制法或中和竞争法。竞争抑制法检测的原理是采用基因工程重组表达的HBeAg包被固相反应板, 在加入待测血清标本的同时加入抗-HBe-辣根过氧化物酶(HRP), 使待测标本中的抗-HBe与抗-HBe-HRP公平竞争结合固相上的HBeAg[5]。该方法由于临床检测时无法按检测原理的“ 理想状态” 而操作, 故常会出现加样时差致“ 不公平竞争” 引起的结果差异。中和竞争法检测的原理是在固相反应板上预包被纯化的抗-HBe, 在加入待测血清标本后, 同时加入酶标记抗体(抗-HBe-HRP)和中和抗原(HBeAg), 使3种抗体竞争结合HBeAg。该方法较少出现前者的“ 不公平竞争” 现象, 且敏感性略高。

本实验检测的455例标本中120例标本检测的A450 nm值位于cut off值附近, 这些是构成临床工作中复检结果差异的重要原因之一。然而, 在检测抗-HBe阳性的结果中, 4种试剂盒结果一致性仅为30.11%。中和试验鉴定进一步证实4种检测试剂均存在一定比例的假阳性或假阴性。其中A、B、C试剂盒检测的假阴性率高达35.0%72.5%, 同时还存在约31.4%77.1%的假阳性。D试剂盒的检测结果也存在37.1%假阳性, 但其假阴性率仅为5.0%。其准确性也明显优于A、B、C试剂。而对于均采用中和竞争法的C和D试剂, D试剂的敏感性和准确性均明显优于C试剂。

采用中和试验鉴定特异性抗体的存在, 其特异性很高, 假阳性的可能性很小, 且简便、实用, 但敏感性相对较低, 对低滴度的抗体不能检出。因此, 我们不能排除在本实验中有少数血清存在低滴度的抗-HBe, 却无法被中和试验检出而被列入假阳性。值得注意的是, 实验中我们还发现这75例有差异的标本中经23种试剂盒检测, 抗-HBe均为阳性的血清中有18.67 %经中和试验确认仍为假阳性, 这提示在日常工作中采用2种试剂盒复检、结果一致确认的方法仍不能很好地保证结果的“ 准确性” 。鉴于目前临床检测抗-HBe大多为ELISA手工操作, 因此我们认为:在尽可能严格操作的前提下, 既要避免因加样时差致“ 不公平竞争” 引起的结果差异[6], 同时要对结果有疑问的标本采用不同生产厂商、不同原理的试剂盒严格复检, 必要时做中和试验鉴定, 以保证检测结果的质量。另外, 希望抗-HBe检测试剂盒的生产厂商能够努力提高产品质量, 以满足临床的需求。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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