引用本文
费凤英, 祝新华. 三种直接胆红素检测系统的性能评价. 25(6): 429-432
FEI Fengying, ZHU Xinhua. Performance evaluation on three kinds of direct bilirubin detection system. Labratory Medicine, 25(6): 429-432  
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《检验医学》编辑部
三种直接胆红素检测系统的性能评价
费凤英, 祝新华
上海市复旦大学附属中山医院青浦分院,上海 201700

作者简介：费凤英,女,1974生,学士,主管技师,主要从事临床检验工作。

摘要
目的

对钒酸盐氧化法、改良J-G法和3,5-二氯苯重氮四氟硼酸盐法(3,5-DCB-4FB)检测直接胆红素(DBil)进行性能评价,探讨3,5-DCB-4FB法是否适用于DBil检测。

方法

用钒酸氧化法、改良J-G法和3,5-DCB-4FB法分别测定血清DBil,探讨3种方法的精密度、线性、敏感性、抗干扰性和回收率。并分别与Doumas法(手工)进行比较。

结果

3种方法平均精密度均在1%~5%之间;平均回收率为103.28%、99.04%、100.69%;线性范围(敏感性)为1.06~335.10 μmol/L(1.06)、1.01~310.00 μmol/L(1.01)、0.76~310.00 μmol/L(0.76)。钒酸盐氧化法抗血红蛋白(Hb)干扰能力优于后2种方法;3种方法与Doumas法进行比较具有良好相关性( r2>0.975),医学决定水平处的系统误差( SE)分别为-9%、-7%、-1.1%。

结论

3,5-DCB-4FB法具有良好的精密度、敏感性、抗干扰能力、线性范围和相关性,与改良J-G法具有很好的一致性。3,5-DCB-4FB法适用于临床常规检测。

关键词: 直接胆红素; 钒酸盐氧化法; 改良J-G法; 3; 5-二氯苯重氮四氟硼酸盐法; 检测系统
中图分类号:R446.1 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)06-0429-04
Performance evaluation on three kinds of direct bilirubin detection system
FEI Fengying, ZHU Xinhua
Zhongshan Hospital of Fudan University, Qingpu Branch, Shanghai 201700, China
Abstract
Objective

To evaluate the performance of 3 kinds of direct bilirubin (DBil) detection system vanadic acid oxidation method, improved J-G method and 3,5- dichlorobenzene diazonium tetrafluoroborate (3,5-DCB-4FB) method, and analyze the applicability of 3,5-DCB-4FB in DBil determination.

Methods

The serum DBil was determined by vanadic acid oxidation method, improved J-G method and 3,5-DCB-4FB method. The precision, linearity, sensitivity, anti-interference ability and recovery were analyzed. The results were compared with those of Doumas method.

Results

The average precisions were from 1% to 5%. The average recoveries were 103.28%, 99.04% and 100.69%. The linear ranges (sensitivities) were 1.06-335.10 μmol/L (1.06), 1.01-310.00 μmol/L (1.01) and 0.76-310.00 μmol/L (0.76). The anti-interference ability of hemoglobin (Hb) of vanadic acid oxidation method was better than those of the other methods. 3 kinds of detection system compared with the Doumas method had a good correlation ( r2> 0.975). The levels of systematic error ( SE) were -9%, -7% and -1.1%.

Conclusions

3,5-DCB-4FB method has a good precision, sensitivity, anti-interference ability, the linear range and relevance. The 3,5-DCB-4FB method has a good consistency with the improved J-G method. 3,5-DCB-4FB method is applicable to routine clinical testing.

Keyword: Direct bilirubin; Vanadic acid oxidation method; Improved J-G method; 3; 5-dichlorobenzene diazonium tetrafluoroborate method; Detection system

随着全自动生化分析仪的普及, 检测系统更为重要。我们对钒酸氧化法、改良J-G法、3, 5-二氯苯重氮四氟硼酸盐法(3, 5-DCB-4FB)进行评价, 并与Doumas法(手工)进行比较。

材料和方法
一、材料

1. 试剂 血清直接胆红素(DBil)Doumas法(手工)试剂盒 (Human, 德国); 钒酸盐氧化法DBil试剂盒(WAKO, 日本); 改良J-G法DBil试剂盒(Roche, 德国); 3, 5-DCB-4FB法DBil试剂盒(Human, 德国)。以上试剂都通过欧洲统一(CE)认证。校准品与质控品使用各试剂配套校准品和质控品进行校准和质量控制。

2. 干扰剂选择 20%脂肪乳剂250 mL(江苏华瑞制药厂, 批号:B0CF034); 100 g/L维生素C(Vit C)注射液(上海新亚药业, 批号:090906); 50%高糖注射液(上海信谊, 批号:090405)。

3. 仪器 日本HITACHI 7170全自动生化分析仪(简称HITACHI 7170); 752型分光光度计(上海医用分析仪器厂)。

二、方法

1. 反应原理 Doumas法(手工)在重氮盐作用下直接生成偶氮胆红素。钒酸盐氧化法在pH值3 左右、有表面活性剂和间接反应胆红素抑制剂的条件下, 样本中的DBil被氧化剂钒酸盐氧化为胆绿素。3, 5-DCB-4FB法在pH值< 1.0条件下, 血清样本中的DBil直接与3, 5-DCB-4FB反应生成偶氮胆红素。

2. 参数设定 3种DBil试剂在HITACHI 7170上按照厂家说明书进行参数设定和操作。分别组成各自的检测系统(简称为钒酸氧化法; 改良J-G法; 3, 5-DCB-4FB法)。

3. 干扰液的制备 (1)脂肪乳干扰液:20%脂肪乳剂用生理盐水4倍稀释到5%; (2)Vit C干扰液:100 g/L Vit C注射液用生理盐水稀释到10 g/L; (3)葡萄糖干扰液:50%高糖注射液; (4)血红蛋白(Hb)干扰液:抽取4 mL新鲜血液用生理盐水反复洗涤数次后, 加入蒸馏水反复摇匀, 使红细胞完全溶解(镜下瑞特染色检查), 离心沉淀后吸取上清液, 用血液分析仪多次检测Hb为72 g/L。

4. 精密度实验 参考美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)EP5-T2文件[1]中关于精密度试验的评价方案进行。取高、低值混合血清在暗室中各自分装成40份, 并于-20 ℃避光冰冻保存。每天2批每批2个浓度每个浓度2次检测样本, 分上午和下午进行。每批检测时在避光状态下完全溶解后检测DBil, 计算精密度。以美国临床实验室改进修正法案(CLIA'88)允许总误差的1/4为标准, 判断检验结果的可比性。

5. 线性评价 参考NCCLS EP6-P文件[2]分别对3种方法进行评价, 取高值(335.1或210 μ mol/L)及低值(4.51 μ mol/L)血清样本各1份(无溶血和脂血), 分别编为⑤号、①号。将⑤ 号高值和①号低值分别按3∶ 1、2∶ 2、1∶ 3的比例混合作为④、③、②号。将5个不同浓度随机排列测定, 每份重复检测4次, 取其均值与设定值做直线回归, 计算偏离直线平均差异(average deviation from linearity, ADL), 以美国病理家学会(CAP)标准进行判断。

6. 敏感性检测试验 用生理盐水做样本分别用3种方法反复检测60次, 均值取绝对值。

7. 干扰实验 参考NCCLS EP7-P文件[3]进行。分别对高、低值混合血清做该实验。Hb干扰实验配置方案与线性评价方案相同, 使用1~5管Hb浓度分别为0、1.8、3.6、5.4、7.2 g/L, 分别进行上机检测。脂肪乳、Vit C和葡萄糖干扰实验方案配置与Hb的干扰配置方案相同。

8. 回收实验 高、低值混合血清均以9∶ 1的比例加入0.9%生理盐水和23.4 μ mol/L DBil标准品, 计算回收率。

9. 比较实验 按照NCCLS EP9-A2[4]文件, 用3种方法分别检测55例不同DBil浓度的样本。对结果进行数据统计, 在去除离群点后分别以Doumas法作为比较方法, 计算其相关系数(r)、回归方程、相对残差(Sy/x )和医学决定水平处的系统误差(SE%)并进行配对 t 检验。

三、统计学方法

数据统计用MedCalc 10.1.8.0统计软件进行数据统计。

结 果
一、 精密度

钒酸盐氧化法、改良J-G法和3, 5-DCB-4FB法低值平均变异系数(CV)分别为4.31%、3.54%、2.68%, 高值平均CV分别为2.88%、2.44%、1.97%。三者均满足CLIA'88要求。3, 5-DCB-4FB法CV明显优于其他2种方法, 结果见表1。

表1 高、低值混合血清的精密度结果
二、线性范围

以钒酸氧化法、改良J-G法和3, 5-DCB-4FB法为Y轴, 以Doumas法为X轴。钒酸氧化法在335.1 μ mol/L范围内线性良好[Y =0.992 0X+4.560 1 , P=0.025, r2=0.999 8, Sy/x =2.040 9, ADL=1.09%< 2.5%(CAP)]。改良J-G法在310 μ mol/L范围内线性良好[Y =1.001 3X+2.034 3, P=0.65, r2=0.999 8, Sy/x =2.292 0, ADL=1.16%< 2.5%(CAP)]。3, 5-DCB-4FB法在310 μ mol/L范围内线性良好[Y =0.994 5X+2.780 6, P=0.12, r2=1.000 0, Sy/x =0.709, ADL=0.35%< 2.5%(CAP)]。

三、检测敏感性

对3种方法检测60次结果, 用95%百分位数进行统计, 检测敏感性为 x-+3s, 结果见表2。

表2 3种方法检测敏感性比较
四、抗干扰性能

1. Hb的干扰 Hb< 3.6 g/L对钒酸盐氧化法检测DBil无明显干扰。Hb< 0.9 g/L对改良J-G法和3, 5-DCB-4FB法测定DBil无明显干扰。Hb浓度增加对改良J-G法和3, 5-DCB-4FB法检测DBil呈明显负干扰。

2. 脂肪乳的干扰 脂肪乳浓度在5%以下对改良J-G法和3, 5-DCB-4FB法检测DBil无明显干扰; 但随着脂肪乳浓度增大, 对DBil检测有明显呈正干扰。脂肪乳浓度在2%以下对钒酸盐氧化法检测DBil无明显干扰; 但随着脂肪乳浓度增大, 对DBil检测呈明显的负干扰。

3. Vit C干扰 Vit C< 200 mg/L对3种方法检测DBil基本无干扰, 高浓度Vit C对3种方法检测DBil产生负干扰。

4. 葡萄糖干扰 葡萄糖< 12.5 mmol/L对3种方法检测DBil无明显干扰。高浓度葡萄糖对改良J-G法和3, 5-DCB-4FB法检测产生负干扰, 对钒酸盐氧化法产生正干扰。

五、回收率

钒酸盐氧化法、改良J-G法和3, 5-DCB-4FB法低值回收率为102.36%、99.50%和100.28%, 高值回收率为104.20%、98.57%和101.10%, 平均回收率为103.28%、99.04%和100.69%。

六、比较实验

用3种方法分别检测55份不同浓度(0~200 μ mol/L)的血清样本, 结果与Doumas法(手工)检测结果进行比较, 差异无统计学意义(P> 0.05)。直线回归方程、r、Sy/x和在医学决定水平处的SE(%), 结果见表3。

表3 各系统直线回归方程、r2值、Sy/x 和SE(%)结果比较

3种方法检测结果分别与Doumas法(手工)检测结果进行比较采用戴明回归(Deming regression), 结果见图1~图3。从图中发现3, 5-DCB-4FB法具有理想的相关性。用改良J-G法作为参考系统, 用布兰德-奥特曼分析法(Bland-Altman plot)分别作钒酸盐氧化法和3, 5-DCB-4FB法系统间差异随机效应分析, 结果见图4、图5。3, 5-DCB-4FB法和改良J-G法随机差异(一致性限度)± 2s(-0.1-3.7)优于钒酸盐氧化法检测系统一致性限度± 2s(-6.28.1)。

图1 钒酸盐氧化法戴明回归分析

图2 改良J-G法戴明回归分析

图3 3, 5-DCB-4FB法戴明回归分析

图4 钒酸盐氧化法对改良J-G法Bland-Altman plot分析图

图5 3, 5-DCB-4FB法对改良J-G法Bland-Altman plot分析图

讨 论

随着国际标准化组织(ISO)15189推广和应用于日常实验室, 对检测结果追求可溯性和可比性, 对检测系统(检测仪器、试剂、校准品和质控品、常规操作程序)要求更加严格。完全使用配套试剂目前还不符合我国国情, 自建系统尤为重要。本研究以DBil为检测对象, 分别选择2种常规方法(钒酸盐氧化法和改良J-G 法)[5]和1种新方法(3, 5-DCB-4FB法)分别同HITACHI 7170组成检测系统。运用NCCLS相关文件和CLIA'88要求, 探讨各种系统检测性能、系统误差和一致性。

本研究3, 5-DCB-4FB法表现出良好的精密度、敏感性和抗干扰性能, 优于钒酸盐氧化法和改良J-G法。3, 5-DCB-4FB法线性范围略低于钒酸盐氧化法, 但是3, 5-DCB-4FB法的相关性最好(r2=1.000 0), ADL值较小(0.35%), 线性拟合较好。虽然3, 5-DCB-4FB法在抗Hb干扰略有增强, 但没有取得创新型突破。3种方法与Doumas法(手工)分明采用直线回归分析, 均显示良好的相关性(r2> 0.975), 而3, 5-DCB-4FB法表现更好。3种方法在医学决定水平处的SE(-9%、-7%、-1.1%)完全满足CLIA'88的要求。3, 5-DCB-4FB法和改良J-G 法之间具有很好一致性, 钒酸盐氧化法表现相对较弱。造成3种方法差异的原因。本研究认为主要是改良J-G法在使用时需要临时配置, 易影响试剂均一性和稳定性; 钒酸盐氧化法需要在表面活性剂和抑制剂的条件下反应, 其表面活性剂和抑制剂选择尤为重要, 本研究使用的校准品是牛血清基质, 对系统造成一定负偏差。3, 5-DCB-4FB法DBil试剂盒是直接上机使用无需配置, 具有良好稳定性。本研究认为3, 5-DCB-4FB法是最佳的方法, 适用于临床DBil常规检测。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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[2] National Committee for Clinical Laboratory Stand ards. Evaluation of the linearity of quantitative analytical methods;proposed guideline[S]. EP6-P, NCCLS, 1986. [本文引用:2]
[3] National Committee for Clinical Laboratory Stand ards. Interference testing in clinical chemistry;proposed guideline[S]. EP7-P, NCCLS, 1986. [本文引用:1]
[4] National Committee for Clinical Laboratory Stand ards. Method comparison and bias estimation using patient samples; approved guideline[S]. EP9-A2, NCCLS, 2002. [本文引用:1]
[5] 叶应妩, 王毓三, 申子瑜. 全国临床检验操作规程[M]. 第3版. 南京: 东南大学出版社, 2006: 452-457. [本文引用:1]