引用本文
吴蓉, 张隆, 戴俊华, 康向东. 革兰阴性杆菌16S rRNA甲基化酶基因检测及作用研究. 25(6): 423-426
WU Rong, ZHANG Long, DAI Junhua, KANG Xiangdong. Study on the determination and its influence of 16S rRNA methylase gene in gram negative bacteria. Labratory Medicine, 25(6): 423-426  
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革兰阴性杆菌16S rRNA甲基化酶基因检测及作用研究
吴蓉, 张隆, 戴俊华, 康向东
上海中医药大学附属普陀医院检验科,上海 200062

通讯作者：康向东,联系电话：021-62160801。

作者简介：吴蓉,女,1970年生,学士,副主任技师,主要从事细菌耐药机制研究。

摘要
目的

分析上海中医药大学附属普陀医院临床分离的革兰阴性杆菌中16S rRNA甲基化酶基因的流行情况及革兰阴性杆菌的氨基糖苷类耐药机制。

方法

收集临床分离的对阿米卡星和/或庆大霉素耐药的革兰阴性杆菌53株。采用聚合酶链反应(PCR)法检测16S rRNA甲基化酶基因:armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、npmA;PCR阳性产物测序分析。构建PET32-armA和PET32-rmtB的重组质粒并转化入宿主菌BL21中。纸片扩散法(K-B)检测临床分离16S rRNA甲基化酶基因阳性菌株和重组菌对5种氨基糖苷类药物的敏感性。

结果

53株耐药菌中5株鲍曼不动杆菌、2株肺炎克雷伯和1株阴沟肠杆菌检出armA基因,2株大肠埃希菌检出rmtB基因。获得PET32-armA和PET32-rmtB的重组BL21菌株。PET32-armA和PET32-rmtB的重组菌均获得氨基糖苷类抗菌药物耐药性。

结论

本院临床样本检测到16S rRNA甲基化酶基因armA和rmtB阳性菌株,armA基因存在于鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌中;rmtB基因位于大肠埃希菌中。将armA和rmtB基因转入非耐药的宿主菌中可以诱导其对氨基糖苷类抗菌药物的耐药。

关键词: 革兰阴性杆菌; 氨基糖苷类; 16S rRNA甲基化酶
中图分类号:R446.5 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)06-0423-04
Study on the determination and its influence of 16S rRNA methylase gene in gram negative bacteria
WU Rong, ZHANG Long, DAI Junhua, KANG Xiangdong
Department of Clinical Laboratory, Putuo Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 200062,China
Abstract
Objective

To analyze the prevalence of the 16S rRNA methylase gene isolated from gram negative bacteria in Putuo Hospital, and study the aminoglycoside resistance mechanisms.

Methods

53 amikacin-resistant and/or gentamicin-resistant isolates of gram negative bacteria were collected. The 16S rRNA methylase genes armA, rmtA, rmtB, rmtC, rmtD and npmA were determined by polymerase chain reaction (PCR), and the sequence of positive products was analyzed. The recombinant plasmids of PET32-armA and PET32-rmtB were constructed and transformed into host strain BL21.The sensitivities to 5 kinds of aminoglycoside of 16S rRNA methylase gene positive strains and recombinant strains were detected by disc diffusion (K-B) method.

Results

The armA was identified in 5 strains of Acinetobacter baumannii,2 strains of Klebsiella pneumoniae and 1 strain of Enterobacter cloacae. The rmtB was identified in 2 strains of Escherichia coli. PET32-armA and PET32-rmtB recombinant bacteria BL21 were obtained. The recombinant bacteria of PET32-armA and PET32-rmtB received aminoglycoside antibiotic resistance.

Conclusions

The 16S rRNA methylase genes armA and rmtB are identified in clinical specimens. The armA gene is identified in Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae and Enterobacter cloacae, and the rmtB gene is identified in Escherichia coli. Transforming armA and rmtB genes into the host strains of non-resistant bacterium can lead to their resistance to aminoglycoside antibiotics.

Keyword: Gram negative bacteria; Aminoglycoside; 16S rRNA methylase

2003年, 日本学者Yokoyama[1]报道了由质粒介导的耐药机制16S rRNA甲基化酶。16S rRNA甲基化酶可导致革兰阴性杆菌对庆大霉素等多种临床常用氨基糖苷类抗菌药物的高度耐药。甲基化酶修饰所有氨基糖苷类共同的作用位点G1405和A1408位氨基酸, 其耐药菌的最低抑菌浓度(MIC)值可高达512~1024 mg/L[1]。目前已发现该酶的编码基因有armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、npmA 6种[2, 3]。近年国内也相继从鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌等革兰阴性杆菌中检出armA、rmtB基因[4, 5]。本研究对临床分离的53株对阿米卡星和/或庆大霉素耐药的革兰阴性杆菌采用聚合酶链反应(PCR)法检测6种16S rRNA甲基化酶基因的携带情况, 应用分子生物学方法构建了PET32-armA和PET32-rmtB的重组质粒并转入宿主菌, 确定了armA和rmtB基因通过质粒的传播途径和作用。

材料和方法
一、材料

1. 菌株来源 收集上海中医药大学附属普陀医院2009年10月至2009年12月临床分离的对阿米卡星和/或庆大霉素耐药的革兰阴性杆菌53株, 其中32株大肠埃希菌、6株肺炎克雷伯菌、5株鲍曼不动杆菌、4株铜绿假单胞菌、2株阴沟肠杆菌、2株嗜麦芽窄食单胞菌、1株恶臭假单胞菌和1株洋葱假单胞菌。均采用法国生物梅里埃公司ATB Expression细菌鉴定仪鉴定。标准菌株为大肠埃希菌ATCC 25922和铜绿假单胞菌ATCC 27853为药敏试验质控菌(由上海市临床检验中心提供)。质粒PET32a作为构建载体, 应用氯化钙法制备大肠埃希菌BL21的感受态细胞作为克隆转化受体菌, 由本实验室保存。

2. 试剂 Pfu酶、dNTP购自上海中晶生物有限公司, 限制性内切酶XhoI、BamHI、普通质粒小提试剂盒、PCR产物纯化试剂盒均购自上海天根生化公司, T4连接酶购自上海皓嘉生物公司, 引物序列根据美国GenBank数据库, 使用Primer5软件设计, 上下游添加酶切位点(斜体表示), 由上海生工生物工程有限公司合成。

二、方法

1. 细菌处理 挑纯培养菌落置入0.5 mL离心管内(内预置200 ng/mL蛋白酶K溶液200 μ L), 56 ℃2 h, 95 ℃10 min, 1 3000 r/min(离心半径为10 cm)离心2 min。上清液即为基因检测的模板液, -20 ℃冰箱保存备用。

2. 基因检测 均为PCR法, 自行设计16S rRNA甲基化酶基因(armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、npmA), 基因引物、靶基因引物序列和目的产物长度。PCR扩增热循环参数为:95 ℃预变性3 min, 然后95 ℃60 s→ 55 ℃60 s→ 72 ℃60 s, 循环30次, 72 ℃延伸10 min, 产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳, 出现与阳性对照分子大小相当的目的条带为阳性, 见表1。

3. 阳性基因测序 纯化后的PCR样本为上海生工生物工程有限公司测序, 双脱氧末端终止法(在美国ABI公司3730型基因分析仪上进行)。

4. armA和rmtB基因的克隆构建 将纯化后的PCR产物和质粒PET32a用BamHⅠ 和XhoI双酶切, 1.5%琼脂糖电泳。胶回收后用T4连接酶连接, 构建armA和rmtB基因PET32重组质粒, 并转化入大肠杆菌BL21 (DE3)中筛选重组子。重组表达质粒经PCR和双酶切验证。验证正确的表达质粒命名为PET32-armA和PET32-rmtB。操作均按说明书进行。

表1 16S rRNA靶基因PCR引物序列

5. 药敏试验 纸片扩散法(K-B) 检测抗菌药物的敏感性。庆大霉素、阿米卡星、奈替米星、妥布霉素和卡那霉素5种药敏纸片和MH平板分别为美国BD公司和上海伊华公司产品, 并根据美国临床实验室标准化研究所(CLSI)2009年版要求进行抗菌药物敏感性判断。

结 果
一、16S rRNA甲基化酶基因的检测

通过PCR扩增临床分离的53株耐药菌株, 其中8株扩增出armA基因(包括5株鲍曼不动杆菌、2株肺炎克雷伯和1株阴沟肠杆菌); 2株大肠埃希菌扩增出rmtB基因, 结果见表2。部分PCR扩增片段, 结果见图1、图2。将扩增出的armA和rmtB进行序列分析, 与GenBank数据库的比对, 序列完全一致, 结果见图3。

图1 armA基因扩增电泳图

图2 rmtB基因扩增电泳图

表2 16S rRNA甲基化酶基因检测结果

图3 armA和rmtB基因测序图

二、质粒构建

将纯化后的armA和rmtB基因PCR产物, 经BamHI和XhoI双酶切, 1.5%琼脂糖电泳。胶回收酶切产物。插入载体PET32a, 构建重组质粒PET32-armA和PET32-rmtB。将重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中, 在氨苄青霉素抗性平板上筛选重组子。PCR鉴定和酶切鉴定, 结果见图4。

图4 重组质粒PET32-armA和PET32-rmtB PCR鉴定及酶切鉴定结果

三、药敏试验

K-B法检测临床分离的10株16S rRNA甲基化酶基因阳性菌株对5种氨基糖苷类抗菌药物的耐药性, 见表3。

表3 10株16S rRNA甲基化酶基因阳性菌株对5种氨基糖苷类抗菌药物的耐药率[株, (%)]

将含有重组质粒PET32-armA和PET32-rmtB的大肠杆菌BL21(DE3)增菌后进行药敏试验, 以含有PET32空质粒的大肠杆菌BL21(DE3)作为空白对照。结果表明, 包含重组质粒PET32-armA和PET32-rmtB的大肠杆菌BL21(DE3)对奈替米星、妥布霉素、卡那霉素、阿米卡星和庆大霉素均获得与原有临床分离株相同的耐药性。

讨 论

氨基糖苷类药物通过与细菌核糖体30S亚基的16S rRNA A位解码区核苷酸形成氢键, 干扰细菌蛋白的合成, 从而发挥抗菌作用。16S rRNA甲基化酶能够使16S rRNA G1405上的N-7位鸟苷变为7-甲基鸟苷或将A1408上的腺嘌呤N-1位甲基化导致氨基糖苷类药物与16S rRNA之间的结合减少而引起多种革兰阴性致病菌的卡那霉素和庆大霉素耐药或引起大肠杆菌的卡那霉素和安普霉素耐药[6]。由于16S rRNA甲基化酶引起的氨基糖苷类抗菌药物的耐药性已经得到国内、外专家的重视, 本院近年来革兰阴性杆菌对庆大霉素的耐药率持续保持在50%~60%, 阿米卡星的耐药率则维持在25%左右, 因此, 解析我院16S rRNA甲基化酶的携带情况对临床有重要意义。

研究表明, 欧洲、亚洲、北美洲的一些国家和地区主要流行armA基因, 在日本检出armA、rmtA、rmtB、rmtC和nmpA 5种基因, 而在中国台湾地区、韩国和比利时主要流行rmtB基因, 在澳大利亚和巴西则分别流行rmtC和rmtD基因[7~9]。本研究通过对53株阿米卡星和/或庆大霉素耐药的革兰阴性杆菌进行6种16S rRNA甲基化酶基因的筛查, 发现8株armA阳性菌, 2株rmtB阳性菌, 且10株阳性株对5种氨基糖苷类类抗菌药物除阿米卡星外几乎全部耐药。

16S rRNA甲基化酶基因与可转移遗传因子(如转座子等)关联, 可通过接合或转化进行快速传播和扩散。16S rRNA甲基化酶基因armA即是复合转座子Tn1548的一部分, 位于一个自身可转移的的质粒上[10]。本研究构建了PET32-armA和PET32-rmtB的重组质粒, 转化入大肠杆菌BL21(DE3), 获得了产生16S rRNA甲基化酶armA和rmtB的BL21菌株, 2种重组菌均具有对氨基糖苷类药物奈替米星、妥布霉素、卡那霉素、阿米卡星和庆大霉素的耐药性, 表明了16S rRNA甲基化酶基因armA和rmtB可通过质粒介导扩散导致革兰阴性杆菌氨基糖苷类抗生素耐药并造成临床耐药菌株的传播。因此, 医务人员和流行病学工作者应高度重视这一耐药现象, 早期筛查具有该基因的病原菌, 并加强监控, 防止传播, 具有重要意义。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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