引用本文
周彬, 潘宇红, 黄飚, 黄旋, 王柯, 朱岚, 张珏. 抗弓形虫IgM抗体时间分辨荧光免疫分析法的建立及初步应用. 25(4): 309-311
ZHOU Bin, PAN Yuhong, HUANG Biao, HUANG Xuan, WANG Ke, ZHU Lan, ZHANG Jue. Establishment and clinical application of the time-resolved fluoroimmunoassay of anti- Toxoplasma-IgM antibody . Labratory Medicine, 25(4): 309-311  
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《检验医学》编辑部
抗弓形虫IgM抗体时间分辨荧光免疫分析法的建立及初步应用
周彬1, 潘宇红2, 黄飚1, 黄旋2, 王柯1, 朱岚1, 张珏1
1. 江苏省原子医学研究所卫生部核医学重点实验室,江苏 无锡 214063
2. 江苏省无锡市第三人民医院检验科,江苏 无锡 214041

通讯作者：黄飚,联系电话：0510-85520770。

作者简介：周彬,男,1981年生,硕士,技师,主要从事标记免疫方面的工作。

摘要
目的

采用时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)建立高灵敏的抗弓形虫(TOX)IgM抗体的检测方法。

方法

采用二抗间接法建立抗TOX IgM抗体的TRFIA。

结果

方法的批内和批间变异系数( CV)分别为1.9%和3.8%,敏感性为0.4 U/mL,可测范围为0.4~200 U/mL,20%、50%和80%的有效剂量(ED20、ED50和ED80)分别为36.3、88.2和147.8 U/mL。检测健康体检人员的血清,标本的测定值为(5.3±2.3)U/mL,建议阳性阈值为10 U/mL。

结论

抗TOX IgM抗体的TRFIA敏感性高、稳定性好,在优生优育及器官移植上具有很好的应用前景。

关键词: 弓形虫; IgM抗体; 时间分辨荧光免疫分析法
中图分类号:R446.61 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)04-0309-03
Establishment and clinical application of the time-resolved fluoroimmunoassay of anti- Toxoplasma-IgM antibody
ZHOU Bin1, PAN Yuhong2, HUANG Biao1, HUANG Xuan2, WANG Ke1, ZHU Lan1, ZHANG Jue1
1. Key Laboratory of Nuclear Medicine, Ministry of Health, Jiangsu Institute of Nuclear Medicine, Jiangsu Wuxi 214063,China
2. Department of Clinical Laboratory, the Third People's Hospital of Wuxi, Jiangsu Wuxi 214041, China
Abstract
Objective

To develop a time-resolved fluoroimmunoassay (TRFIA) with high sensitivity for the detection of anti- Toxoplasma (TOX)-IgM antibody.

Methods

The tested specimen or reference standard was added to micro-titer plate coated with the TOX antigen and the europium-labelled anti human IgM antibody was added.

Results

The between-run and within-run coefficients of variation( CV) of this TRFIA were 1.9% and 3.8% respectively. The sensitivity was 0.4 U/mL. The range of testing was from 0.4 to 200 U/mL. The TRFIA provided a linear dose response with 20% effective dose (ED20), 50% effective dose (ED50) and 80% effective dose (ED80) of 36.3, 88.2 and 147.8 U/mL, respectively. The value of healthy subjects sera was (5.3±2.3) U/mL, so whose value over 10 U/mL would be reported as positive.

Conclusions

The TRFIA of anti-TOX-IgM antibody is a method with high sensitivity and stability and it has application perspective in aristogenesis and organ transplantation.

Keyword: Toxoplasma; IgM antibody; Time-resolved fluoroimmunoassay

弓形虫(Toxoplasma, TOX)是一种对人类具有极大潜在危害的细胞内寄生原虫, TOX病是一种动物原性疾病, 呈世界范围流行。我国人群TOX感染率为5%~20%。TOX病与优生优育关系密切, 孕妇感染TOX后, 无论有无临床症状, TOX速殖子均会穿过胎盘屏障传染给胎儿, 造成胎儿宫内感染, 常致畸胎、死胎, 存活者也常有畸形、弱智及发育障碍[1]。目前国内外对TOX感染的实验室诊断主要依靠血清IgG、IgM抗体检测, 而IgM的检测更适合于早期诊断[2]。本研究采用重组TOX抗原和双功能螯合剂异氰酸苄基二乙烯三胺四乙酸络合铕(Eu3+)标记的羊抗人IgM抗体, 建立了能定量、敏感性较高、示踪物稳定的时间分辨荧光免疫分析法(time-resolved fluoro-immunoassay, TRFIA)检测血清中的抗TOX-IgM抗体。

材料和方法
一、材料

1. 仪器与试剂 全自动TRFIA检测仪AutoDELFIA-1235为EG& G-Wallac公司产品; 96孔微孔板为Nunc公司产品; TOX抗原、羊抗人IgM二抗由晶美公司提供; Eu3+标记试剂由Wallac公司提供; Sephadex-G25为Pharmacia公司产品; 抗TOX IgM抗体酶联免疫试剂盒购自德国赛润公司; 浓缩洗涤液、增强液及反应缓冲液由江苏省原子医学研究所提供。其他试剂均为国产分析纯。

2. 标本来源 标本由江苏省江原医院检验科及无锡市第三人民医院检验科提供, 静脉采血后分离取血清, -20 ℃冷冻保存。

二、方法

1. 固相抗原包被方法 将TOX抗原用50 mmol/L Na2CO3-NaHCO3 (pH值9.6)缓冲稀释制成包被液, 96孔微孔板各孔加100 μ L, 4 ℃包被过夜。弃去包被液, 冲洗3次, 每孔加150 μ L 含3 g/L 牛血清白蛋白的上述缓冲液封闭, 室温放置2 h。弃去封闭液, 拍干后真空抽干, 板条密封后置-20 ℃冷冻保存。

2. Eu3+标记抗体的制备方法 羊抗人IgM抗体参照Eu3+标记盒说明书操作。羊抗人IgM抗体经PD210 柱转换缓冲条件, 收集蛋白峰, 浓缩至2 g/L。取500 μ L加入含0.2 mg的Eu3+-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu3+-DTTA) 冻干粉的小瓶中, 25 ℃磁力搅拌反应20 h。反应液经用80 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)(pH值7.8)缓冲液平衡的Sephadex-G25柱(1 cm× 40 cm) 层析, 紫外分光光度计吸光度(A280)监测, 收集蛋白峰, 稀释后分装冻干保存。

3. 标准品配制方法 用标准品稀释液将已由进口试剂盒标定值后的已知抗TOX IgM抗体含量的血清稀释成一系列抗TOX IgM抗体标准溶液, 浓度为200、100、50、20、10和0 U/mL, 0点为标准品稀释液。

4. 测定方法 采用二抗间接法, 即加100 μ L 抗TOX IgM抗体参考标准或用反应缓冲液1∶ 4稀释的血清到板条中, 25 ℃反应30 min后, 用洗涤液洗4次, 然后加分析缓冲液稀释的Eu3+-TOX IgM抗体100 μ L, 25 ℃振荡反应45 min后, 用洗涤液洗6次, 再加200 μ L增强液振荡5 min, 在AutoDELFIA-1235 仪上检测荧光信号。最后从标准曲线计算标本中的抗TOX IgM 抗体的含量。

5. 类风湿因子(RF)对检测抗TOX IgM抗体的影响 取RF阳性且未感染过TOX的血清12份, 按照上述检测方法重复检测2次。

6. 试剂盒的考核方法 对试剂盒进行剂量-反应曲线的线性、精密度、敏感性、特异性、稳定性等项目考核, 对用自己试剂盒所测结果和赛润公司的试剂盒所测结果进行比较。

结果
一、Eu3+标二抗的理化和免疫学鉴定

Eu3+标羊抗人IgM 二抗经Sephadex-G25层析, 收集第一洗脱峰。EG& G Wallac公司提供的Eu3+含量为0.02 μ mol/L, 二抗蛋白含量为0.006 μ mol/L, 即平均每个二抗上连接了3.33个Eu3+。被测物浓度和反应发光强度基本成算术级正比关系, 说明羊抗人IgM抗体免疫反应性基本无损失, 定量分辨率较好。

二、抗TOX IgM抗体TRFIA的考核

1. 抗TOX IgM抗体TRFIA标准曲线 经双对数法函数数据处理程序处理得到抗TOX IgM抗体TRFIA的标准曲线, 见图1。

图1 抗TOX IgM抗体TRFIA的标准曲线

2. RF对检测抗TOX IgM抗体TRFIA的干扰 应用RF乳胶试剂盒检测为阳性的血清12份, 再用本试剂盒检测其抗TOX IgM抗体, 12份血清抗TOX IgM抗体值均小于正常值范围, 表明RF对本试验干扰不大。

3. 精密度评价 按操作步骤操作, 任选不同浓度(6.9、29.3和131.7 U/mL)的3份标本, 10孔平行测定, 计算测定结果的平均浓度( )与标准差(s), 计算批内变异系数(CV)和批间CV。批内平均CV为1.9%, 批间平均CV为3.8%。见表1。

表1 抗TOX IgM抗体TRFIA的精确性试验结果

4. 敏感性及测量范围 以10组标准曲线零点计数所对应的值求得 和s, 以 +2s为其敏感性, 计算得0.4 U/mL, 其抗TOX IgM抗体测量范围为0.4~200 U/mL。

5. 特异性试验 收集血吸虫IgM抗体阳性3份、RF阳性血清12份、肝炎阳性血清19份、风疹病毒IgM抗体阳性5份、巨细胞病毒IgM抗体阳性23份, 用自制的TOX IgM试剂盒检测, 结果均≤ 10 U/mL, 皆为阴性, 显示本试剂盒与血吸虫、RF、肝炎、风疹病毒、巨细胞病毒交叉反应较小, 特异性较好。

6. 稳定性 将一试剂盒置37 ℃水浴箱中7 d, 再与正常保存的试剂盒做对比, 结合率下降约17%, 8条不同时间进行测定的抗TOX IgM抗体TRFIA的20%有效剂量(ED20)、50%有效剂量(ED50)、80%有效剂量(ED80)分别为36.3、88.2和147.8 U/mL, 其余指标没有明显变化, 说明试剂盒稳定性良好。

7. 临床初步应用 用本研究建立的TRFIA试剂盒测定177名正常人血清的抗TOX IgM抗体, 结果为(5.3± 2.3)U/mL, 建议阳性阈值为10 U/mL。以此范围为参照值, 采用本试剂盒与德国赛润公司的抗TOX IgM抗体酶联免疫试剂盒同时测定149例血清标本。两试剂盒阳性一致率为93.65%, 阴性一致率为97.67%, 总一致率为95.97%, 调整一致性为95.87%, 约登指数为0.913 2。两试剂盒所测得的数值有显著相关性, Y=1.335X-4.491, 其相关系数为0.939。在149例血清标本中, 本研究建立的TRFIA检测结果与临床一致者有140份, 诊断敏感性为90.5%, 诊断特异性为96.5%, 阳性预测值为93.4%, 阴性预测值为94.3%, 总有效率为94.0%, 阳性似然比为25.857 1, 阴性似然比为0.108 8。德国赛润公司的酶联免疫试剂盒检测结果与临床一致者有135份, 诊断敏感性为87.3%, 诊断特异性为93.0%, 阳性预测值为91.7%, 阴性预测值为89.9%, 总有效率为90.6%。本研究建立的TRFIA有较好的临床应用价值, 且各评价指标要好于德国赛润公司的酶联免疫试剂盒。见表2。

表2 自制TRFIA试剂盒与赛润酶联免疫试剂盒的相关性
讨论

TRFIA因稀土离子的荧光半衰期长, 介于10~1 000 μ s之间, 所以比普通荧光高5~6个数量级, 延缓测量时间后, 可消除来自标本、试剂及其他的非特异荧光, 从而提高敏感性, 又因稀土离子的激发光和发射光之间有一个较大的斯托克斯(stokes)位移, 这有利于排除其他非特异荧光的干扰, 所以方法的特异性较高[2]。

用传统间接法检测血清中IgM抗体时, 易受到血清中RF和特异性IgG抗体的干扰。我们研制的抗TOX IgM抗体TRFIA试剂盒在标本稀释液中加入了含有羊抗人IgG等的特定吸附剂, 试验结果表明添加有特定吸附剂的反应缓冲液可有效减少这些因素的干扰, 提高了特异性和敏感性。

目前仅有德国赛润公司的抗TOX IgM抗体酶联免疫试剂盒能对其定量检测, 但该试剂盒具有标本需稀释、检测结果评估复杂、敏感性较低且CV值较高等缺点。而我们研发的TRFIA试剂盒解决了赛润公司试剂盒的这些问题, 标本可直接加样25 μ L不需稀释, 可根据检测结果直接评估, 敏感性达到了0.4 U/mL, 且该法具有定量、操作简便、示踪物稳定、价格优势明显等优点, 所以该法的成功研发能够用于TOX感染者的疗效判断、原发性感染判断及疫苗免疫效果的判断, 在优生优育及器官移植上具有很好的应用前景。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] 朱国珍, 王玉金, 朱国琴, 等. 几种弓形虫IgM酶联免疫吸附试验的建立及评估[J]. 中国人兽共患病杂志, 2003, 19(5): 92-94. [本文引用:1]
[2] 李振甲, 陈绊藻, 高平, 等. 时间分辨荧光分析技术与应用[M]. 北京: 科学出版社, 2000: 5-10. [本文引用:2]