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罗柳林, 应春妹, 倪培华, 叶杨芹, 汪雅萍, 张灏旻, 于嘉屏. 耐碳青霉烯类抗菌药物鲍曼不动杆菌膜蛋白机制研究. 25(4): 304-308
LUO Liulin, YING Chunmei, NI Peihua, YE Yangqin, WANG Yaping, ZHANG Haomin, YU Jiaping. Research on the outer membrane protein mechanism of carbapenemase resistance on Acinetobacter baumannii . Labratory Medicine, 25(4): 304-308  
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耐碳青霉烯类抗菌药物鲍曼不动杆菌膜蛋白机制研究
罗柳林1, 应春妹1, 倪培华2, 叶杨芹1, 汪雅萍1, 张灏旻1, 于嘉屏1
1. 上海交通大学医学院附属仁济医院检验科,上海 200127
2.上海交通大学医学院附属瑞金医院检验系,上海 200025

通讯作者：应春妹,联系电话：021-58394934。

作者简介：罗柳林,男,1982年生,硕士,主要从事临床细菌耐药机制研究。

摘要
目的

研究耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌膜蛋白机制并了解其流行型别。

方法

收集仁济医院、瑞金医院和上海市第六人民医院鲍曼不动杆菌共85株,其中亚胺培南和美罗培南耐药菌49株,敏感菌36株。用细菌基因组回文结构重复序列-聚合酶链反应(REP-PCR)分析其流行型别,PCR扩增检测碳青霉烯类水解酶及金属酶,对阳性扩增菌株进行DNA测序分析,同时用超声波和超速离心法提取细菌的膜孔蛋白并用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析。

结果

49株耐亚胺培南和美罗培南鲍曼不动杆菌中,REP-PCR分析结果以A型为主,与敏感菌株存在很大差异;耐药菌株中oxa-51均为阳性,45株为oxa-23阳性;36株敏感菌株中检测到1株oxa-58阳性,29株为oxa-51阳性;金属酶(VIM和IMP-1/4型)均阴性;膜蛋白分析显示,在36株耐药株中38 000附近条带缺失,而在30株敏感株中有17株在相应位置处表达该条带。

结论

耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌主要以A型流行,产oxa-23水解酶和38 000附近膜孔蛋白条带缺失可能是其主要耐药机制。

关键词: 鲍曼不动杆菌; 碳青霉烯类; 膜蛋白; 耐药机制
中图分类号:R378.99 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)04-0304-05
Research on the outer membrane protein mechanism of carbapenemase resistance on Acinetobacter baumannii
LUO Liulin1, YING Chunmei1, NI Peihua2, YE Yangqin1, WANG Yaping1, ZHANG Haomin1, YU Jiaping1
1.Department of Clinical Laboratory, Renji Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200127, China
2. Department of Clinical Laboratory, Ruijin Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200025, China
Abstract
Objective

To investigate the outer membrane protein mechanism of carbapenemase resistance on Acinetobacter baumannii and its epidemic patterns.

Methods

85 Acinetobacter baumannii strains, including 49 imipenem-resistant and meropenem-resistant strains and 36 sensitive strains, were collected from Renji hospital, Ruijin hospital and Shanghai sixth people's hospital. The epidemic patterns were analyzed by repetitive extragenic palindromic-polymerase chain reaction(REP-PCR)and the carbapenemase and metalloenzymes were detected by PCR amplification. The outer membrane proteins were extracted by sonication and ultracentrifuge and analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) after the positive results were sequenced.

Results

Type A was the major pattern in total carbapenemase resistance bacteria, but the patterns were very different from sensitive ones. The PCR results indicated that 45 isolates were positive for oxa-23 and all oxa-51 were positive in carbapenemase resistance isolates. Among 36 sensitive strains, 1 isolate was positive for oxa-58 and 29 isolates were positive for oxa-51. The metalloenzymes, VIM and IMP-1/4, were all negative. Around position 38 000, 17 of 30 sensitive isolates were expressed this protein while no one was detected in 36 resistance ones.

Conclusions

Type A is the major epidemic pattern in carbapenemase resistance Acinetobacter baumannii. The production of oxa-23 carbapenemase and the loss of 38 000 outer membrane protein may be the major mechanism.

Keyword: Acinetobacter baumannii; Carbapenemase; Outer membrane protein; Resistance mechanism

鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)是不动杆菌属中最常见的一种革兰阴性球杆菌, 该菌广泛分布于医院环境中, 是一种重要的条件致病菌, 能引起一系列院内感染, 如菌血症、尿路感染、继发性脑膜炎、手术部位感染及呼吸机相关性肺炎等, 严重威胁患者的生命, 尤以重症监护病房(ICU)感染率和病死率最高[1]。对碳青霉烯类抗菌药物耐药的报道出现于90年代, 现在有些地区已经高达25%。最近报道对多黏菌素和替加环素的耐药使得目前对这种难治细菌已没有药物可以选择[2]。我们从碳青霉烯类水解酶、膜孔蛋白等并结合同源性分析来了解耐碳青霉烯类抗菌药物鲍曼不动杆菌的耐药机制及其流行型别。

材料和方法
一、材料

1. 菌株来源 收集2007年仁济医院、瑞金医院、上海市第六人民医院的非重复亚胺培南和美罗培南耐药鲍曼不动杆菌49株以及对亚胺培南和美罗培南敏感的鲍曼不动杆菌36株。

2. 药敏纸片和试剂 阿米卡星、庆大霉素、氨苄西林、氨苄西林-舒巴坦、哌拉西林、头孢唑啉、头孢克洛、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢他啶、亚胺培南、环丙沙星、复方磺胺甲口恶唑、头孢哌酮-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦、头孢吡肟、美罗培南、头孢丙烯等抗菌药物均购于Oxoid公司; DNA提取试剂盒购自上海生工公司; DNA DL2000 Marker购自TaKaRa公司; 聚合酶链反应(PCR)试剂购自Promega公司; 细菌混合性蛋白酶抑制剂、十二烷基肌氨酸钠(SLS)和蛋白酶抑制剂(PMSF)购自Sigma公司; 微量蛋白定量试剂盒购自Pierce公司; Acr/Bis购自上海闪晶生物有限公司。

3. 主要仪器 Eppendorf低温高速离心机, ABI7000实时定量PCR仪, 宁波新芝超声破碎仪, 日立低温超速离心机, 琼脂糖凝胶电泳仪和天能凝胶成像仪, Bio-Rad蛋白电泳仪。

二、方法

1. 抗菌药物体外药物敏感试验 纸片扩散法, 根据2008年美国临床实验室标准化研究所(CLSI)标准判断药敏结果[3]。用WHONET 5.1软件进行数据处理。

2. 同源性分析 应用基因组回文结构重复序列(REP)-PCR引物进行扩增, 其反应体系(25 μ L)为:5× 缓冲液5 μ L, Mg2+(3 mmol/L)3 μ L, dNTPs 混合物(各2.5 mmol/L)0.5 μ L, 引物(10 μ mol/L)0.5 μ L, 模板3 μ L, Taq酶0.3 μ L(1.5 U), dH2O 12.7 μ L。引物序列为:P1 5'-IIIGCG CCGICATCAGGC-3', P2 5'-ACGTCTTATCAGGCC TAC-3'。循环条件为:94 ℃变性1 min, 40 ℃ 退火1 min, 65 ℃延伸8 min, 重复35个循环。

3. PCR扩增检测 用生工革兰阴性菌DNA基因组提取试剂盒制备模板, 引物由上海闪晶生物有限公司合成, PCR扩增所用引物见表1[4~6], 其反应体系(20 μ L)均为:5× 缓冲液4 μ L, Mg2+(2 mmol/L)1.6 μ L, dNTPs混合物(各2.5 mmol/L)0.4 μ L, 引物(10 μ mol/L)0.4 μ L, 模板1 μ L, Taq酶0.2 μ L(1 U), dH2O 12.4 μ L。反应条件为:94 ℃变性30 s, 52 ℃/ 50 ℃/60 ℃退火45 s, 72 ℃延伸1 min, 重复30个循环。

表1 基因合成引物序列表

4. 测序 PCR扩增产物由上海闪晶生物有限公司测序, 结果在GenBank中BLASTn进行序列比对以确定基因型别。

5. 膜孔蛋白提取和十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析 30 mL 牛肉汤(LB)增菌过夜, 超声破碎细菌外膜, 其间加入细胞混合性蛋白酶抑制剂和PMSF(均为1 mmol), 3 000 r/min(离心半径为8 cm)低温离心去除未破碎细菌, 取上清, 于23 700 r/min (离心半径为8 cm)超速离心1 h后取沉淀, 随后用SLS溶解膜蛋白并室温放置30 min, 于23 700 r/min(离心半径为8 cm)超速离心1 h, 去上清, 重复1次, 最后沉淀溶解在含1%SDS的三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液(TE)中。所有标本均等量上样进行SDS-PAGE, 其中分离胶浓度为12%, 积层胶为5%, 积层胶电压为80 V, 分离胶电压为120 V, 电泳结束后考马斯亮蓝染色并脱色后观察条带[7, 8]。

结果
一、药敏试验结果

亚胺培南和美罗培南耐药菌株中对其他抗菌药物均耐药, 而对头孢哌酮-舒巴坦的耐药率为70.0%, 敏感率为9.2%, 中度敏感率为20.8%; 在敏感的菌株中耐药率> 80.0%的有:氨苄西林、头孢克洛、头孢呋辛; 在40.0%~80.0%之间的有:庆大霉素、哌拉西林、头孢噻肟、头孢他啶、环丙沙星、复方磺胺甲口恶唑; < 40.0%的有:阿米卡星、氨苄西林-舒巴坦、头孢哌酮-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦、头孢吡肟; 对亚胺培南、美罗培南、头孢唑啉和头孢丙烯全部敏感。

二、同源性分析结果

49株耐亚胺培南和美罗培南鲍曼不动杆菌可以分为A、B、C、D 4个型别, 见图1, 其中A型共46株(A1型32株, A2型12株, A3型和A4型各1株), B、C、D型各1株。敏感菌株中有2株与A1型别一致, 见图2, 其他型别不一致, 差异很大。

图1 耐亚胺培南和美罗培南菌株不同型别电泳图

图2 亚胺培南和美罗培南敏感菌株的型别分析图

三、PCR扩增检测结果

49株全耐药鲍曼不动杆菌中, oxa-23阳性45株, oxa-51均阳性, 见图3, oxa-24均阴性, oxa-58均阴性, VIM和IMP-1/4全阴性; 在敏感菌株中检测到1株oxa-58阳性, 见图4, oxa-51阳性29株, 其他基因均阴性。

图3 部分oxa-23和oxa-51型水解酶阳性菌株电泳图

图3 部分oxa-23和oxa-51型水解酶阳性菌株电泳图

图4 oxa-58扩增阳性菌株电泳图

分别选取耐亚胺培南和美罗培南鲍曼不动杆菌36株和敏感菌株30株, 36株耐药菌株在38 000附近菌株膜孔蛋白全部缺失或明显下调, 而17株敏感菌株则依然表达相应条带, 见图5。

图5 膜孔蛋白的SDS-PAGE分析结果图

五、测序结果

分别选取oxa-23、oxa-51和oxa-58阳性菌株进行序列测定, 结果在GenBank中进行BLASTn比对分析确定为其基因。

讨论

鲍曼不动杆菌耐碳青霉烯类抗菌药物耐药机制研究目前还处于初步阶段[9], 就其流行型别来说, 由于目前全球性的分析比对方法如多序列位点测序分型(MLST)等还处于建设和收集整理中, 所以很多结果也只是各单位内部或是区域性的比较。我们应用REP-PCR同源性分析显示, 仁济医院、瑞金医院和上海市第六人民医院耐亚胺培南和美罗培南的鲍曼不动杆菌主要以A型为主, 在敏感的菌株中也发现了2株这一型别, 考虑为同一克隆传播, 说明了这一型别耐药株的重要意义。

其耐药机制目前国内外研究报道主要是产碳青霉烯类水解酶。本研究结果显示, 在所有检测的耐药株中, oxa-23阳性45株, 为主要产酶型别, 与我们前期的研究结果和国内其他学者报道的结果基本一致[10~12]; oxa-51均阳性, 未检测到其他类型; 而在敏感菌株中只有6株未检测到oxa-51, 但检测到1株oxa-58阳性, 未检测到其他基因型别。oxa-51是鲍曼不动杆菌的标志基因, 仅仅就oxa-23水解酶还难以造成临床上这种全耐药现象的出现, 于是我们进行了膜孔蛋白机制的探索研究。

鲍曼不动杆菌具有脂质双层的外膜, 与其生物膜成分一样, 外膜蛋白也以双分子层形式构建。质膜是使其与外界环境有所分隔的一个装置, 同时质膜使其内外保持种种联系, 这种作用主要是依赖膜蛋白。可以通过结构变化和调控其膜蛋白基因表达来调控抗菌药物进入菌细胞内的量, 致使临床的治疗无效。膜孔蛋白在细菌耐药机制方面发挥重要的作用。对于通过膜孔蛋白进入菌细胞的碳青霉烯类抗菌药物来说, 膜孔蛋白通透性降低将会使其耐药性增加。因为水溶性的药物相对分子质量通常大于一般的营养物质, 而且他们主要是经膜孔蛋白进入胞内, 所以膜孔蛋白的缺失将对其耐药产生重大的影响。

我们分别选取了非重复患者的36株耐药菌株和30株敏感菌株, 提取相应膜蛋白并进行SDS-PAGE分析。研究发现, 在所有耐药的菌株中, 均不表达38 000附近的蛋白条带, 然而在对照的敏感菌株中多数表达此相应条带, 由此我们推测这一蛋白条带的缺失可能参与了耐碳青霉烯类抗菌药物的形成, 这与国外学者报道基本一致[13~16]。

综上所述, 鲍曼不动杆菌耐碳青霉烯类抗菌药物的机制主要以水解酶的产生和膜孔蛋白的缺失为主, 本课题组将继续研究其具体的机制, 以期为临床的治疗提供更多的参考意见。

The authors have declared that no competing interests exist.

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