引用本文
李莉, 林晓丹, 温旺荣. 茎环引物的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测miR-155表达及其临床初步应用. 25(4): 296-300
LI Li, LIN Xiaodan, WEN Wangrong. Development and clinical primary application of SYBR Green Ⅰ FQ-PCR with stem-loop RT primer to detect miR-155. Labratory Medicine, 25(4): 296-300  
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《检验医学》编辑部
茎环引物的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测miR-155表达及其临床初步应用
李莉, 林晓丹, 温旺荣
暨南大学附属第一医院临床医学检验中心, 广东 广州 510630

通讯作者:温旺荣, 联系电话: 020-38688438。

作者简介：李莉,女,1982年生,硕士,主要从事临床分子生物学研究。

摘要
目的

建立茎环状逆转录引物(简称茎环引物)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR),并作初步应用。

方法

应用SYBR GreenⅠ实时FQ-PCR检测CD4+T细胞株的miR-155,初步验证方法的可行性。用所建立的方法对60份临床宫颈刮取物标本进行检测,分析miR-155与宫颈癌及感染的高危型人类乳头状瘤病毒(HPV)基因型别的关系,其聚合酶链反应(PCR)反应产物通过电泳验证产物特异性。

结果

所建方法能特异的检测到miR-155的扩增信号,最低检出限为10-7 nmol/L, 在10-1~10-6 nmol/L之间有良好的线性关系,相关系数( r)为0.99,扩增后惟一的熔解曲线特异峰显示很好的特异性。CD4+T细胞株及60例临床宫颈刮取物标本miR-155均显示阳性, PCR反应产物电泳可获得单一条带。宫颈刮取物miR-155与宫颈癌有关( P<0.05),但与本研究涉及的HPV基因型别无关( P>0.05)。

结论

所建立的茎环引物的SYBR GreenⅠ实时FQ-PCR能快速、敏感、特异地检测细胞株和临床宫颈刮取物miR-155的表达水平,为进一步研究miR-155及其临床应用奠定了基础。

关键词: 微小RNA; 逆转录聚合酶链反应; miR-155; SYBR GreenⅠ
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1673-8640(2010)04-0296-05
Development and clinical primary application of SYBR Green Ⅰ FQ-PCR with stem-loop RT primer to detect miR-155
LI Li, LIN Xiaodan, WEN Wangrong
Center of Clinical Laboratory Medicine,the First Affiliated Hospital of Jinan University,Guangdong Guangzhou 510630,China
Abstract
Objective

To establish a method of SYBR GreenⅠreal-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR) with stem-loop reverse transcription (RT) primer to detect miR-155 and apply it primarily.

Methods

miR-155 in CD4+T cell was determined by SYBR GreenⅠreal-time FQ-PCR. The feasibility of this method was primarily validated. miR-155 in 60 cell specimens scraped from the cervix was detected. The relation of miR-155 with cervix cancer and HPV genotypes was analyzed. The PCR production was analyzed by agarose gel electrophoresis.

Results

The results showed that the SYBR GreenⅠFQ-PCR with stem-loop RT primer was highly specific and had a broad linear detecting range (10-1nmol/L-10-6 nmol/L, the lowest detecting limit: 10-7 nmol/L, r=0.99). The melting curve analysis showed a single peak. The results from CD4+ T cell lines and 60 cell specimens scraped from the cervix in this assay showed positive. The PCR product migrated as a pure band during electrophoresis. The expression of miR-155 in cell specimens scraped from the cervix was not related to their HPV genotypes in this study( P>0.05), but was related to cervix cancer( P<0.05).

Conclusions

The method of SYBR GreenⅠFQ-PCR with stem-loop RT primer can detect miR-155 rapidly, sensitively and specifically in cell lines and cell specimens scraped from the cervix. It lays a foundation to further study on the miR-155 and its clinical application.

Keyword: microRNA; Reverse transcription polymerase chain reaction; miR-155; SYBR Green Ⅰ

微小RNA(microRNA, miRNA)是一组由动物、植物和病毒基因组所编码的单链小RNA(~22nt), 他们能够与特定的目标mRNA结合, 使其降解或抑制其表达, 从而导致特定基因的沉默, 对机体的各种生理和病理过程进行调节, 与机体疾病, 特别是与肿瘤或病毒感染相关[1]。迄今, 最新版本的miRNA数据库(miRBase http://www.mirbase.org/)收录的植物、动物和病毒的miRNA序列已经达到10 867种, 其中人类的占721种。许多研究表明, 在一些恶性肿瘤中存在某些miRNA的升高或降低, 并且在同一种肿瘤的不同发展阶段miRNA表达水平也不同, 提示了miRNA在肿瘤基因诊断方面的作用。miR-155是最早发现的具有促癌活性的miRNA。在人各种肿瘤类型中都发现了miR-155的高表达, 包括B细胞淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、结肠癌和甲状腺癌等[1~5]。随着对这一领域研究的不断深入, miR-155与疾病之间的相互关系将更趋于明朗化, 最终使其更好地应用于疾病的诊断、治疗及预后判断等, 而这一切都有赖于建立理想的检测方法。其中应用茎环结构逆转录引物的荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)具有较高的特异性和敏感性, 且操作简便, 更适合于临床应用[6]。

高危型人类乳头状瘤病毒(HPV)的持续感染是宫颈癌的病因。在超过95%的早期浸润性宫颈癌中, 至少发现20种致癌HPV基因型[7]。有研究表明, 在宫颈癌标本中存在miR-155表达水平的增高[8], 但对临床宫颈刮取物的标本尚未研究。我们建立了茎环引物的SYBR GreenⅠ 实时FQ-PCR检测miR-155的方法, 应用此种方法检测了60例宫颈刮取物标本中miR-155的表达水平。

材料和方法
一、材料

1. 实验对象 (1)CD4+T细胞用于方法的建立, 由南方医科大学附属南方医院内分泌实验室赠送; (2)来自本院妇产科宫颈无明显异常的对象15例, 经病理学诊断为宫颈癌25例以及宫颈炎的患者20例, 取宫颈刮取物标本。

2. 主要试剂和仪器 新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司); RPMI1640培养基(Gibco公司); 胰蛋白酶和青/链霉素混合液(广州展晨生物科技有限公司); 总RNA提取试剂Trizol(美国Invitrogen公司); 茎环结构逆转录引物根据成熟miR-155的序列UUAAUGCUAAUC-GUGAUAGGGGU设计, 由上海吉玛制药技术有限公司设计并合成(公司未予公开); 逆转录所需的dNTPs、逆转录酶、氯仿、无水乙醇、异丙醇和焦碳酸二乙酯(DEPC)水(广州市达晖生物技术有限公司); 100 bp DNA Ladder Marker(北京普博欣生物科技有限责任公司); 改良导流杂交法HPV 21种基因型检测试剂及HybrMax基因杂交仪(凯普生物科技有限公司); ABI Prism® 7000 FQ-PCR仪; KDC-160HR高速冷冻离心机(中国科技大学中佳公司); ESCO生物安全柜(Ⅱ 级B2型); Biophotometer生物分光光度计(Eppendorf公司)。

二、方法

1. 方法的建立 用CD4+T细胞验证所建立的miR-155检测方法的可行性。(1)细胞培养:CD4+T细胞培养于含10%新生牛血清的RPMI1640培养液中(含有青/链霉素各100 U/mL), 37 ℃, 5%CO2, 2 d换液1次, 细胞生长1周左右传代; (2) 总RNA 提取:离心收集细胞, 加入TRIzol试剂反复吹打裂解细胞(加TRIzol试剂前不必洗涤细胞, 以避免RNA的降解), 之后用氯仿、异丙醇及DEPC水配制的75%的乙醇来分离和纯化RNA, RNA最后溶于DEPC水中, 暂存于-20℃(因miRNA较大片段RNA稳定, 故提取与保存采用上述方法), 1周内测定; (3) 逆转录反应:反应体系总体积取20 μ L, 各组分终浓度分别为逆转录缓冲液1× 、dNTP 0.375 mmol/L、miRNA茎环结构逆转录引物60 nmol/L、MMLV逆转录酶20 U、总RNA 样品0.2 ng~200 ng, DEPC水加至20 μ L; 逆转录反应参数为16 ℃ 30 min→ 42 ℃ 30 min→ 85 ℃ 10 min, 将人工合成的miRNA标准品(上海吉玛制药技术有限公司合成)以DEPC水稀释7个数量级, 即10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6及10-7 nmol/L, 分别取每一数量级稀释液2 μ L进行逆转录以及后续的PCR, 用以制作标准曲线, 每反应设复孔; (4) 实时FQ-PCR:反应体系总体积取20 μ L, 各组分浓度分别为PCR缓冲液1× (内含SYBR GreenⅠ 荧光染料)、miRNA特异引物0.08 μ mol/L、Taq DNA聚合酶5 U/μ L、miRNA逆转录产物2 μ L, DEPC水加至20 μ L; PCR反应参数为95 ℃ 10 min→ (95 ℃ 12 s)→ (62 ℃ 50 s), 40个循环→ 20 ℃ 2 min; 扩增时增加设置熔解曲线判断是否有非特异性的扩增和引物二聚体的出现, 阴性对照以双蒸水代替逆转录产物; (5)PCR反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳, 观察产物的有无及大小。

2. 临床初步应用 取15例宫颈无明显异常者、20例宫颈炎患者及25例宫颈癌患者的宫颈刮取物分别检测HPV基因型, 并用建立的方法检测miR-155的表达。(1)HPV筛查标本的采集和处理:由妇产科医生按试剂盒的说明书的要求采集, 采集后立刻置于保存液中尽快送检; (2) 改良导流杂交法[10]检测HPV基因型:实验操作与结果判断按试剂盒要求进行, 其步骤包括宫颈细胞HPV DNA 提取、PCR扩增、核酸分子快速导流杂交、酶标显色和结果分析; (3) 所有宫颈刮取物用我们建立的方法测定miR-155表达水平, 包括总RNA提取、逆转录、FQ-PCR及反应产物的电泳分析。各标本提取RNA后测定RNA浓度, 在逆转录反应阶段统一取200 ng的总RNA加入, 体积差异用DEPC水补足至20 μ L。

三、统计学方法

实验数据采用SPSS13.0软件处理。各组间测定结果以miR-155表达量对数的 ± s表示, 2组间比较用t检验, P< 0.05为差异有统计学意义。

结果
一、所建方法的主要参数

1. 标准曲线及敏感性分析 实验结果表明用于逆转录的总RNA量在0.2~200 ng范围内均可得到FQ-PCR扩增产物, 标准品成功进行了特异性扩增, 可见到平滑典型的PCR反应曲线, 检测到的最高稀释度为10-7 nmol/L, 但仅在10-1 nmol/L至10-6 nmol/L范围内Ct值和荧光值对数才呈良好线性关系, r2为0.99。见图1。

图1 6个浓度梯度的标准曲线图

2. 熔解曲线及产物的电泳验证 在约(82± 0.5)℃处呈现单峰, 没有引物二聚体和其他非特异峰的存在, 阴性对照可与阳性反应的峰明显区分开来。PCR反应产物经琼脂糖电泳后可见单一的约为80 bp的条带。见图2。

图2 标准品PCR反应产物电泳图

3. SYBR GreenⅠ 实时FQ-PCR检测CD4+T细胞标本的结果 对培养不同天数的CD4+T细胞的miR-155进行检测, 培养1至7 d的7份CD4+T细胞标本的PCR反应结果可见到明显的阳性扩增曲线, 见图3。培养1至7 d的7份标本细胞浓度分别为3.15× 105、4.52× 105、5.70× 105、6.65× 105、7.62× 105、1.02× 106、1.6× 106个/mL, 各个标本对应的miR-155浓度为8.50× 10-4、4.17× 10-4、5.89× 10-4、 8.13× 10-4、8.32× 10-4、4.27× 10-4、3.02× 10-4 nmol/L。

图3 CD4+T细胞标本PCR反应曲线图

二、临床初步应用

1. HPV筛查标本的基因型 宫颈无明显异常者和宫颈炎患者所测HPV型别均显示阴性, 宫颈癌患者HPV DNA阳性, 分别为HPV-16型4例, HPV-58、52、18、31、33、39和68型各3例, 均为高危型。

2. 检测60份宫颈刮取物标本miR-155 60份临床标本均可看到扩增曲线, 但表达程度不同, 见图4。熔解曲线分析显示反应具有特异性。宫颈癌患者临床标本的miR-155的表达高于宫颈炎及宫颈无异常者(P< 0.05)。宫颈癌患者HPV各型之间miR-155表达量差异无统计学意义(P> 0.05), 见表1。PCR反应产物电泳后可见单一的约为80 bp的条带, 与标准miR-155的PCR反应产物电泳结果一致。

图4 宫颈刮取物标本PCR反应曲线图(部分)

表1 60例临床宫颈刮取物标本的检测结果比较(± s)
讨论

miRNA已成为近年来分子生物学领域研究的热点, 在机体生理、病理过程中的的重要作用日益受到关注。而miR-155代表着一大类多功能miRNA中的典型[11], 其在造血系统的分化、免疫、感染、心血管疾病、病毒感染和肿瘤的发生等过程中扮演着非常重要的角色。在包括B细胞淋巴瘤、白血病、甲状腺肿瘤、乳腺癌、结肠癌、宫颈癌及胰导管腺癌等恶性肿瘤中, miR-155的表达是上升的, 这就为某些肿瘤的基因诊断及预后的判断开拓了一条新思路, 而一种合适的检测方法是必不可少的。

miRNA的检测方法有很多种[6], 最经典的方法是Northern blot, 但由于操作繁琐、技术难度大、耗时长、实验条件要求高, 在实际工作中难以推广应用。而基于基因杂交的其他方法如原位杂交技术和微阵列技术等则不能定量或仅能半定量。与传统方法相比, 实时FQ-PCR具有快速、灵敏和准确的的特点。FQ-PCR根据荧光来源的不同可分为TaqMan 探针法和SYBR Green Ⅰ 荧光染料法。与TaqMan探针法相比, 染料法的优点是SYBR-GreenⅠ 能与所有的双链DNA相结合, 通用性好, 不必针对不同的模板而设计不同的探针, 价格相对较低, 易于临床应用。但也正是由于SYBR GreenⅠ 染料的这种特点, 由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。因此使用SYBR Green Ⅰ 荧光染料法时, 有必要优化引物的浓度, 并且同时设定熔解曲线分析, 观察反应的特异性。本研究检测miRNA应用的是SYBR Green Ⅰ 实时FQ-PCR。其定量分析分2个步骤, 即茎环结构逆转录引物的逆转录反应和实时FQ-PCR。茎环结构的逆转录引物在逆转录后增加了cDNA的长度, 克服了miRNA长度短小而难于检测的困难。

高危型HPV的持续感染是宫颈癌的病因, 有研究表明宫颈癌细胞中miR-155表达量是增高的[7]。改良导流杂交法是集PCR技术、核酸杂交技术、基因芯片技术和酶联免疫吸附试验(ELISA)技术于一体的HPV基因型分型检测的新方法, 能同时对21种HPV基因进行分型, 且可判断多重感染[10]。本研究应用SYBR GreenⅠ 染料茎环状逆转录引物FQ-PCR检测临床上的宫颈刮取物标本, 目的是考察宫颈刮取物标本中miR-155表达量的改变以及不同型别HPV感染对miR-155表达量的影响。虽然宫颈癌、宫颈炎和宫颈无异常者的临床标本中miR-155均有表达, 但宫颈癌患者临床标本的miR-155的表达量高于宫颈炎及宫颈无异常者(P< 0.05)。另外, 本研究宫颈癌患者标本HPV各型标本之间miR-155表达量无差异(P> 0.05)。因此, miR-155的表达与宫颈癌的有无相关, 而与本研究涉及的HPV的型别无关。与其他高危基因型是否相关有待于扩大检测型别进一步验证。

本研究建立的SYBR GreenⅠ 实时FQ-PCR检测miR-155是一种快速、有效、灵敏度高、特异性好和定量检测范围宽的方法, 易于推广应用。也可用于研究miR-155在宫颈癌发生、发展、治疗以及预后中的作用。miR-155在其他肿瘤或病毒感染中的作用值得深入研究。

The authors have declared that no competing interests exist.

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